Диссертация (1091617), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Для образцовсоптическойплотностьюбольше0,3проводилосьразбавлениекульттуральной жидкости дистиллированной водой до достижениязначения оптической плотности 0,3 или меньше. Измерение роста клетокпосле достижения фазы линейного роста затруднено еще и увеличениемколичества мертвых клеток, что, соответственно, приводит к увеличениюошибки при определении ростовых характеристик. Однако зависимостьоптической плотности от времени достоверно показывает общий характерскорости роста культуры микроорганизмов. Кривые роста75дрожжейDebaryomyces hansenii представлены на рисунке 14, дрожжей рода Ogataeaangusta и Arxula adeninivorans на рисунке 15.Рисунок 14.
Кривые роста дрожжей Debaryomyces hansenii3,0Оптическая плотность, А2,52,01,51,0Arxula adeninivorans ВГИ 78-6Arxula adeninivorans ВКМ Y-2677Ogataea angusta ВКМ Y-13970,50,001020304050Время культивирования, часыРисунок 15. Кривые ростадрожжей Ogataeaadeninivorans76angusta и ArxulaГрафическая зависимость оптической плотности культуральнойжидкости от времени имеет сигмоидальную форму и является типичнойкривой роста дрожжевых штаммов.
Аппроксимация проводилась впрограмме Sigma Plot по сигмоидальному уравнению. На кривых ростадрожжевых культур, обычно выделяют несколько фаз роста:1.Индукционный период (лаг-фаза). Индукционный периоднаступает после пересеивания и в ней происходит адаптация дрожжевыхклеток к новой культуральной среде, перестраивается клеточныйметаболизм. Влаг–фазе практическине происходит образованиепродуктов и увеличение числа клеток [94].2.Фаза экспоненциального роста. В этой фазе происходитбыстрое (экспоненциальное) накопление биомассы дрожжей и продуктових жизнедеятельности. Фаза экспоненциального ростахарактеризуетсячастыми митозы в сравнении с остальными фазами [94].3.Фаза линейного роста.
Характеризуюется уменьшением числамитозов и линейным увеличением числа дрожжевых клеток во времени.4.Фазазамедленногороста.Вэтойфазепроисходитзначительное уменьшение числа митозов, что приводит к уменьшениюроста дрожжевой культуры.5.Стационарная фаза. Характеризуется постоянством числаклеток.
В стационарной фазе происходит прекращение митотическогоделения клеток, или число умирающих клеток равно числу делящихся[94].6.Фаза отмирания. В этой фазепрактически отсутствуетмитотическое деление м преобладают процессы гибели клеток.Проведено определение продолжительности основных фаз ростадрожжей, параметры представлены в таблице 10.77Таблица 10. Продолжительность основных фаз роста дрожжейШтамм дрожжейO.
angustaВКМ Y-1397А.adeninivoransВКМ Y-2677А.adeninivoransВГИ 78-6D. hanseniiВКМ Y-2482D. hanseniiВКМ Y-111D. hanseniiВКМ Y-1585D. hanseniiВКМ Y-1050Лаг фаза, Экспонен Линейная ФазаСтацион Удельнаяциальная фазазамедлени арнаяскоростьчфаза, чроста, ч я роста,ч фаза, ч роста, ч-10–1212–1616–3030–3838–500,1600–1010–1414–2828–3434–500,1580–1010–1818–2626–3838–500,1440–88–1212–2020–4040–500,2590-1212-2020-3030-3838-500,3240-1212-1818-2626-3636-500,3240-1818-2828-3232-4040-500,252Удельная скорость роста клеточной культуры (µ, ч-1) - зависит отконцентрации лимитирующего субстрата и определяется на начальномэтапе (экспоненциальная+линейная фазы) накопления биомассы (N), гдеможно пренебречь расходованием субстрата.скоростиростапроводилосьпоНахождение удельнойуравнениюln N ln N 0 t .Исследование кинетики роста дрожжей по экспериментальным даннымпроводили в полулогарифмических координатах (логарифм оптическойплотности (lnA) от времени культивирования (t,ч)).
Удельную скоростьроста дрожжевой культуры (µ) находили как тангенс угла наклона прямойв координатах lnA от t. Логарифм начального числа клеток (lnN0) равенординате точки пересечения с осью y [94].Наибольшей удельной скоростью роста обладают дрожжи D.hansenii ВКМ Y-111 и D. hansenii ВКМ Y-1585, что может вызвать ихпреобладание в ассоциации с другими дрожжами, обладающими меньшейудельной скоростью роста.78Послепроведениясравнительногоанализпродолжительностиосновных фаз роста дрожжевых культур (таблица 10) и субстратнойспецифичности (рисунок 13), были выбраны штаммы микроорганизмовдля создания ассоциаций.Ассоциацию 1 составили микроорганизмы A.adeninivorans ВКМ Y2677 и O.angusta BKM Y-1397. Микроорганизмы A.
adeninivorans обладаютширокой субстратной специфичностью (рисунок 13) и являются базовымив ассоциации. Добавление к ним микроорганизмов O. angusta ВКМ Y-1397позволяет расширить спектр окисляемых субстратов за счет метанола,глицерина, вторичных и разветвленных спиртов. Кроме того, клетки A.adeninivorans ВКМ Y-2677 и O. angusta ВКМ Y-1397 имеют сходные фазыроста (таблица 10) и близкие значения удельной скорости роста (0,158 ч-1 и0,160 ч-1), и можно предположить, что доминирования одного видадрожжей над другим не произойдет.Ассоциацию 2 составили микроорганизмы A. аdeninivorans ВКМ Y2677, O.
angusta BKM Y-1397 и D. hansenii ВКМ Y-2482. Добавлениедрожжей D. hansenii к ассоциации 1 позволяет еще расширить спектрокисляемых субстратов, включив в него некоторые нитрофенолы ипищевыедобавки(4-нитрофенолибензоаткалия).Однакопродолжительность основных фаз роста культур заметно отличается.Дрожжи D. hansenii ВКМ Y-2482 являются самым быстро развивающимсявидом микроорганизмов из трех культур (удельная скорость ростасоставляет 0,259 ч-1).3.2.2 Изучение стабильности во времени созданных ассоциацийНестабильность состава ассоциаций микроорганизмов во времениявляется главным препятствием к практическому внедрению БПКбиосенсоров на их основе, поэтому проведено исследование по выявлениюколичества жизнеспособных клеток в сформированных ассоциациях(рисунок 16).7955A.adeninivorans ВКМ Y-2677O.angusta ВКМ Y-13974KOE*108KOE*10A.adeninivorans ВКМ Y-2677O.angusta ВКМ Y-1397D.
hansenii ВКМ Y-248284321321000714212835420Время, дни71421283542Время, дниРисунок 16. Определение количества жизнеспособных клеток дрожжей вассоциациях в течение времени высевом на плотные питательные среды:А) ассоциация дрожжей O. Б)ассоциациядрожжейA.angustaBKMY-1397иadeninivorans ВКМ Y-2677, O.A.adeninivorans ВКМ Y-2677angusta BKM Y-1397 и D. hanseniiВКМ Y-2482.Во всех работах по созданию БПК-биосенсоров на основеискусственныхассоциаций[1,24]показанообщеевремяфункционирования биосенсоров, однако оно может быть обусловленовысокой выживаемостью только двух или одного из используемыхмикроорганизмов. Поэтому актуальным представлялось изучить видовуюустойчивость микроорганизмов в созданных ассоциациях.
Видовуюустойчивостьво времени (42 суток) в ассоциациях изучали методомоптического микроскопирования и методом Коха. Условия храненияассоциаций соответствовали условиям использования в биосенсорноманализаторе (комнатная температура, ежедневное промывание растворомглюкозо-глутаматной смеси с БПК5 = 20 мг/дм3 и трехкратное промываниебуферным раствором).Результаты исследования (рисунок 16) показали, что соотношениеклеток разных видов дрожжей в ассоциации A.adeninivorans BKM Y-2677 иO.
angusta BKM Y-1397 с течением времени не изменялось, посколькуданные микроорганизмы имеют схожие удельные скорости роста.Соотношение микроорганизмов в ассоциации A. аdeninivorans ВКМ Y2677, O. angusta BKM Y-1397 и D. hansenii BKM Y-2482 изменилосьтолько к концу периода исследования и составило 1:1:4. Необходимоотметить, что доминирование микроорганизмов D. hansenii BKM Y-2482 в80ассоциации начинает наблюдаться к концу срока исследования.
Порезультатам анализа методом Коха, подтвержденных данными оптическоймикроскопии до 23 дня исследований, соотношение микроорганизмов вданной ассоциации практически не меняется. Невысокая стабильностьассоциации дрожжей A. adeninivorans, O. angusta и D. hansenii, скореевсего, связана с более высокой скоростью роста и активным протеканиемпроцессов метаболизма микроорганизмов D. hansenii. Удельная скоростьроста клеточной культуры D.
hansenii составляет 0,259 ч-1, в то время какдля дрожжей A. adeninivorans и O. angusta удельная скорость роста 0,158 ч1и 0,160 ч-1 соответственно.Таким образом, при создании рецепторных элементов БПК-биосенсоровна основе сформированных ассоциаций необходимоучитывать, что окислительная активность для ассоциации A. аdeninivoransY-2677, O. angusta BKM Y-1397 и D. hansenii BKM Y-2482 после 20-тиднейможетопределятьсятолькоодним(доминирующим)видоммикроорганизмов.3.3 Разработка матрицы на основе гидрогеля поливиниловогоспирта модифицированного N-винилпирролидоном,подходящей для иммобилизации микроорганизмовКлючевым моментом в формировании стабильного рецепторногоэлементаОсновнымиБПК-биосенсора является иммобилизация микроорганизмов.требованиями,предъявляемымикматрицамдляиммобилизации микроорганизмов, являются: высокий уровень диффузиисубстратов и продуктов, нерастворимость в водных средах (наличиесетчатой структуры), высокая емкость, механическая прочность.
Вкачествесинтетическогогелеобразователячастоиспользуютполивиниловый спирт (ПВС) [95-96]. Однако применение ПВС в качествеосновы рецепторного элемента биосенсорного анализатора затруднено, так81как он образует тонкие, растворимые в воде пленки с низкой механическойпрочностью. Для создания сетчатых структур ПВС одним из подходовявляется введение сшивающих агентов [97-98].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
