Диссертация (1091617), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Полученную суспензию переносили впланшет (d=5 мм) и оставляли до высыхания при температуре 18-220 С.Полученный иммобилизованный биокатализатор хранили при температуре+40 С. Толщину полученного биорецепторного элемента измеряли спомощью микрометра. Перед использованием пленку биокатализаторавынимали из планшета и помещали ее на поверхность кислородногоэлектрода типа Кларка и фиксировали с помощью нейлоновой сетки.2.10 Определение ростовых параметров микроорганизмовКультивированиедрожжейпроводилипутёмперекрыванияинтервалов времени, в течение которых проводилась оценка оптическойплотности культуральной среды. Измерения оптической плотностисуспензии проводили фотометрическим методом на спектрофотометреСФ-103 (ООО «Аквилон», Россия) при длине волны 590 нм и толщинекюветы 1 см относительно кюветы с дистиллированной водой, каждые 2часа в течение 4 суток.
По полученным данным зависимости оптическойплотности от времени были построены кривые роста микроорганизмов.2.11 Сканирующая электронная микроскопияАнализ образцов поливинилового спирта, модифицированного Nвинилпирролидоном,содержащих69инесодержащихклеткимикроорганизмов проводили с помощью сканирующего электронногомикроскопа JSM-6510 LV («JEOL», Япония).2. 12 Определение БПК5 стандартным методом разбавленияВ качестве референтного метода для определения БПК5 былиспользован метод разбавления. Анализ проводили в соответствии сметодикой,указаннойрастворенноговкислородаПНДФв[7].Определениеисследуемыхпробахсодержаниявыполнялиамперометрическим методом в соответствии со стандартной методикой.703.
Обсуждение результатов3.1. Выбор биологического материала для создания БПКбиосенсора на основе индивидуальной культурымикроорганизмовВыборбиологическогоматериала,составляющегоосновурецепторного элемента БПК-биосенсора, производился по способностимикроорганизмов окислять широкий спектр органических субстратов, поустойчивостиприиммобилизациинакислородномэлектродеистабильности при работе.Диализная мембрана позволяет обеспечить работу биоматериала внаиболее мягких условиях. Таким образом, удается избежать связывнияактивных центров ферментов в составе целых клеток как в случеиммобилизации методом химической сшивки, а также избежать потериактивности при адсорбции на стекловолоконном фильтре.
Методиммобилизации с применением диализной мембраны является наиболеепростым, в сравнении с другими методами иммобилизации (например,включениевгели),ипозволяетпроверитьжизнеспособностьмикроорганизмов сразу после их иммобилизации. Диализная мембранаD9777фирмыSigmaпредназначенадляудерживаниябелковсмолекулярной массой свыше 12000 Да, что позволит надежно фиксироватьдрожжевые клетки и свободно пропускать низкомолекулярные субстраты.Проведенаоценкасубстратнойспецифичностидрожжейиммобилизованных с примененим диализной мембраны (рисунок 13) по12 субстратам, относящимся к различным классам органических веществ(спирты, углеводы, аминокислоты, карбоновые кислоты, поверхностноактивные вещества и нитрофенолы), которые могут быть обнаружены вобразцах природных и сточных вод.71Ответ биосенсора, %100806040200A.adeninivorans ВГИ 78-6A.adeninivorans ВКМ Y-2677метанолглюкозаглицинC.
boidinii ВКМ Y-2356этанолфруктозадодецилсульфат натрияС. maltosa ВКМ Y-2359пропанолсахарозабензоат калияC. blankii ВКМ Y-2675глицеринглутуминовая кислота4-нитрофенолОтвет биосенсора, %100806040200D.hansenii ВКМ Y-2482РисунокD.hansenii ВКМ Y-11113.D.hansenii ВКМ Y-1585СубстратнаяD.hansenii ВКМ Y-1050O.angusta ВКМ Y-1397специфичностьдрожжейиммобилизованных с примененим диализной мембраны.Рассматриваемые дрожжи вида Arxula adeninivorans (ВГИ 78-6 иВКМ Y-2677), представленные на верхней гистограмме (рисунок 13), неспособны окислять метанол, спирты разветвленного строения, а такжемногоатомные спирты, что ограничивает их использование при созданиирецепторных элементов БПК-биосенсоров для анализа спиртосодержащихстоковцеллюлозно-бумажнойпромышленности,предприятийпопроизводству синтетических волокон и пластмасс. Профили субстратнойспецифичности дрожжей Candida boidinii ВКМ Y-2356, Candida maltosaВКМ Y-2359 и Сandida blankii ВКМ Y-2675 характеризуются низкими илиотсутствующими ответами на дисахариды, аминокислоты и поверхностноактивныевещества,чтопрепятствуетиспользованиюданныхмикроорганизмов для анализа образцов сточных вод биотехнологическихпроизводств, а также стоков глюкозо-паточных производств.
ДрожжиCandida boidinii ВКМ Y-2356не способны окислять глюкозу –неотъемлемую составляющую сточных вод дрожжевых, пивоваренных,целлюлозно-бумажныхзаводов,атакжеосновнойкомпонентглюкозоглутаматной смеси (ГГС), стандартного раствора, применяемого72при определении биохимического потребления кислорода (БПК). Дляпортрета субстратной специфичности метилотрофных дрожжейвидаOgataea angusta ВКМ Y-1397, характерно окисление низших спиртов,однако, поверхностно- активные вещества, нитрофенолы, а такжераспространенная пищевая добавка – бензоат калия не подвергаютсяокислению данным видом дрожжей.Дрожжи D. hansennii ВКМ Y-1585 и ВКМ Y-1050 хорошо окисляютмоно- и дисахариды, но практически не окисляют спирты и глутаминовуюкислоту.
Дрожжи D. hansennii ВКМ Y-2482 и ВКМ Y-111 характеризуютсянаиболее широкой субстратной специфичностью и окисляют веществабольшой группы представленных классов органических соединений, вкоторую входят спирты, углеводы, аминокислоты и поверхностноактивные вещества, нитрофенолы, которые могут быть обнаружены всточных водах. Однако низкие ответы биосенсора на основе дрожжей D.hansennii ВКМ Y-111на этанол, не позволяют использовать данныйштамм для определения БПК в стоках производств органического синтеза,пищевой,фармацевтической,парфюмернойидругихвидовпромышленности (в сточных водах производства полиэтилена можетсодержаться до 860 мг/дм3 этанола (БПК 1560 мг/дм3)) [92].Характеристикойиммобилизацииустойчивостиявляетсядолговременнаямикроорганизмовстабильность,прикотораяопределяет работу сенсора в течение длительного периода времени.
Оназависит от природы биоматериала и от способа иммобилизации клеток,поэтому для изучения сравнительной устойчивости микроорганизмовиспользовалиметодиммобилизациис применениемвдиализноймембраны, как наиболее простой в исполнении. В таблице 9 предствленыосновные характеристики биосенсоров на основе иммобилизованныхдрожжей.73Таблица 9. Основные характеристики биочувствительных элементовна основе иммобилизованных дрожжейШтамм дрожжейO. angusta ВКМ Y-1397А. adeninivorans ВКМ Y2677А.
adeninivorans ВГИ 78-6С. boidinii ВКМ Y-2356C. maltosa ВКМ Y-2359C. blankii ВКМ Y-2675D. hansenii ВКМ Y-2482D. hansenii ВКМ Y-111D. hansenii ВКМ Y-1585D. hansenii ВКМ Y-1050Количество Долговременная Операционнаяокисляемых стабильность, стабильность,субстратовсутки%(из 12)8264,48323,38274,76124,58164,26144,612353,212153,99103,77173,9Показано, что лучшей долговременной (35 суток) и операционной(3,2 %) стабильностью обладает биосенсор на основе микроорганизмовDebaryomyceshanseniiBKMY-2482(35суток).Операционнаястабильность, представленная в таблице 9, характеризует устойчивостьработы сенсора при проведении большого числа последовательныхизмерений.На основе полученных результатов для дальнейших исследований посозданию рецепторного элемента на основе индивидуальной культурымикроорганизмов были выбраны дрожжи Debaryomyces hansennii ВКМ Y2482 характеризующиеся наибольшей долговременной и операционнойстабильностью, а также широкой субстратной специфичностью.
Длясоздания искусственных ассоциаций, как наиболее перспективные,выбраны дрожжи родов O. аngusta, А.adeninivorans и D. hansenii.3.2 Составление искусственных ассоциаций микроорганизмовДля расширения спектра окисляемых субстратов и повышенияправильности определения биохимического потребления кислорода для74создания БПК-биосенсоров используют ассоциации микроорганизмов,однако они могут быть нестабильны во времени за счет изменения составаконсорциума. В литературе показано, что деградативная активностьконсорциума не всегда равна сумме активностей отдельных штаммов,кроме того, в ряде случаев активность ассоциации может быть даже ниже,чем у составляющих её монокультур [93].
Данный эффект можетобъясняться возникновением конкуренции между штаммами ассоциацииза наиболее легкоутилизируемый субстрат. Поэтому для составлениякомпозиции, обладающей широкой субстратной специфичностью, сотсутствием конкурирующих взаимодействий между микроорганизмами вее составе необходимо, чтобы микроорганизмы обладали разным наборомферментных систем и таким образом дополняли друг друга.Основными критериями подбора микроорганизмов в ассоциациюбыли субстратная специфичность (рисунок 13), продолжительность исовпадение основных стадий роста чистых культур, а также удельнаяскорость роста клеточных культур.3.2.1 Кривые роста дрожжейКривые роста дрожжей были получены фотометрическим методом(изменение оптической плотности культуральной жидкости во времени).Для растворов, сильно рассеивающих свет (культуральная жидкость),закон Бугера-Ламберта-Бэра не применим, однако существует линейнаязависимостьмеждупоглощениемсветадрожжевойсуспензиииколичеством клеток в ней при оптической плотности до 0,3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
