Диссертация (Оценка спектра мутаций гена ATP7B и клинического полиморфизма болезни Вильсона-Коновалова), страница 8

Общий уровень меди в сывороткекрови при БВК может быть как сниженным менее 100 мкг/дл, так и быть в пределахнормы, и резко повышенным при фульминантном гепатите (в связи с выходом медив кровь при цитолизе гепатоцитов). Уровень свободной меди может иметьдополнительное диагностическое значение, а также используется для контроля заэффективностью лечения [184].43Существенное диагностическое значение, в особенности для пациентов сбессимптомным течением, имеет определение содержания меди в сухом веществепечени.

В норме содержание меди в сухом веществе печени составляет15-55 мкг/г,у гетерозиготных носителей мутаций гена ATP7B – до 250 мкг/г, при БВК же онопревышает 250мкг/г.Тем не менее, ни один из биохимических маркеров не является строгоспецифическим для БВК, а некоторые из них могут иметь нормальные значения.Эта высокая степень изменчивости делает затруднительной диагностику поклиническим и биохимическим проявлениям.Для объективизации постановки диагноза в 2001 году была принятаЛейпцигская количественная шкала диагностики БВК (8th International Meeting onWilson’s disease, Leipzig, 2001) (таблица 4), которая рекомендована Европейскойассоциацией по изучению печени в качестве основы для диагностики БВК [29].Таблица 4.

Лейпцигская количественная шкала диагностики болезни ВильсонаКоновалова.ПризнакКольцо КайзераФлейшераНеврологическиепроявленияКонцентрациясывороточногоцерулоплазминаВыраженностьприсутствуетОтсутствуетТяжелыеЛегкиеотсутствуютнормальная (более 0,2 г/л или 200 мг/л)0,1 – 0,2 г/л (или 100-200 мг/л)менее 0,1 г/лприсутствуетКумбс-негативнаяанемияОтсутствуетболее 4 µмоль/г (в 5 раз выше верхнейграницы нормы)0,8 – 4 µмоль/гСодержание мединормальное (менее 0,8 µмоль/г илив сухом веществе50 мкг/г)печениНаличие роданин-позитивных гранул(при отсутствии возможности количественногоопределения меди)Норма (менее 0,9 мкмоль/сут х 1,73 м2балл202100121021-11044или < 57 мкг/сут.

х 1,73 м2)Менее чем в 2 раза выше верхней границы1нормыЭкскреция меди сБолее чем в 2 раза выше верхней границымочой2нормыНорма, однако более 5N после пробы с Д2пеницилламинаВыявлена мутация на 1 хромосоме1ГенетическийВыявлены мутации на обеих хромосомах4анализМутаций не выявлено0Итого:4 и более баллов – диагноз БВК подтвержден3 балла – диагноз БВК вероятен, требуется дальнейшее обследованиеМенее 2 баллов – диагноз БВК маловероятенВсем перечисленным показателям присвоено определенное количествобаллов, причем успешное обнаружение мутаций в гомозиготной или компаундгетерозиготной форме соответствует 4 баллам и само по себе достаточно дляподтверждения диагноза БВК.Aggarwa A.

et al. предложили более усложненную, двухуровневую шкалуоценки БВК (англ. Global Assessment Scale, GAS) [34]. Годом ранее аналогичнуюшкалу предложили ученые из Германии (Leinweber B. et al.), делая акцент напсихиатрических и неврологических симптомах БВК [121]. Несмотря наинформативность, эти шкалы не получили значительного распространения вклинической практике, вероятно из-за своей массивности.Неотъемлемым методом диагностики БВК является МРТ-исследование,которое позволяет визуализировать очаги атрофии, затрагивающие различныеотделы головного мозга.

Структурные очаговые изменения чаще встречаются ввиде двусторонних симметричных участков в области базальных ганглиев, безпризнаков перифокального отека. Аналогичные очаги обнаруживаются и вталамусе, стволе и мозжечке. На МРТ-снимках очаги атрофии имеютспецифический вид, называемый в рентгенологии «симптом морды панды» и«симптом трилистника» [157].45Нужно помнить, что даже при проведении полного набора типичныхдиагностических тестов, их результат может быть сомнительным [88].лабораторнойдиагностикеложноположительныеиБВКвнекоторыхложноотрицательныеслучаяхрезультаты.ПринаблюдаютсяТак,например,исследование уровня сывороточного церулоплазмина, который при БВК обычноснижен, может давать ложноотрицательный результат при выраженном гепатите,беременности, терапии эстрогенами. Ложноположительный результат (снижениецерулоплазмина в отсутствие БВК) иногда наблюдается у гетерозиготныхносителей мутаций в ATP7B, синдроме мальабсорбции, ацерулоплазминемии.Полный перечень причин ошибочных результатов тестов представлен в таблице 5(перевод данных, приведенных в EASL) [70].Таблица 5.

Причины ложноположительных и ложноотрицательных результатовтестов для диагностики БВК.ПоказательСывороточныйцерулоплазминМедь всуточной мочеСывороточнаясвободнаямедьТипичноеизменениепри БВКЛожноотрицательный ЛожноположительныйрезультатрезультатВ норме, если:- ВыраженныйгепатитСнижен,- Беременностьменее 50% от - Терапиянормального эстрогенамиуровня- Иммунологическийанализ далзавышенныйрезультатУ взрослых В норме, если:>1.6- Неправильно собранммоль/сутматериалУ детей- Ребенок без>0.64признаков пораженияммоль/сутпечениВ норме, если:- иммунологический>1.6 ммоль/ланализдалзавышенный- Синдроммальабсорции- ацерулоплазминемия- Гетерозиготныйноситель БВКПовышена при:- Некрозе гепатоцитов- Холестазе- Контаминацииматериала46Содержаниемеди в печениКольцоКайзераФлейшера>4 ммоль/гсухой массырезультатцерулоплазминупо-Отсутствует у:- 50% пациентов спеченочной формойПрисутствуетБВК- асимптоматичныхсибсовХолестазПрисутствуют при: Первичномбилиарном циррозеТаким образом, спектр возможных клинических проявлений БВК крайнеширок, и может имитировать многие другие заболевания.

Даже при исследованиихарактерных для БВК биохимических маркеров могут наблюдаться сомнительныерезультаты, что затрудняет своевременную диагностику. В то же время,своевременно назначенное лечение (диета и медьэлиминирующие препараты)способно повлечь значительное улучшение состояния пациента и изменитьпрогноз.1.6.2. Молекулярно-генетические методы диагностикиКак было указано выше, обнаружения мутации в гомозиготной иликомпаунд-гетерозиготной форме в гене ATP7B при подозрении на БВК достаточнодля подтверждения диагноза. В связи с этим актуально проведение молекулярногенетической диагностики – как для уточнения патологии, так и для пониманияпрогноза для потомства.Обычно в этих целях применяется ПЦР на наиболее частые мутации вуказанном гене. Информативность исследования при этом ограничена количествомисследуемых мутаций.

Этот метод позволяет выявить от 45 до 60% мутантныхаллелей.Достаточно часто у пациента не обнаруживается частых мутаций [179]. Втаком случае показано проведение секвенирования – определения полнойпоследовательности гена. Классическим методом, используемым для этого,является секвенирование по Сэнгеру. Этот метод был предложен Фредериком47Сэнгером в 1977 году и дал возможность получать прочтения последовательностиДНК до 1000 нуклеотидов длиной [97]. Секвенирование по Сэнгеру – очень точныйметод и считается на данный момент золотым стандартом диагностикимоногенных заболеваний.

Однако, ему присущи и определенные недостатки. К нимотносятся небольшая пропускная способность, сложность в масштабируемости,низкая скорость проведения анализа, и, что небезразлично пациенту, высокаястоимость. Учитывая, что у большинства пациентов клиническая картинапозволяет диагностировать БВК, а молекулярно-генетические анализы не входят впрограмму обязательного медицинского страхования и требуют оплаты самимпациентом, многие отказываются от предложенной молекулярно-генетическойдиагностики этим методом.Для преодоления перечисленных недостатков секвенирования по Сэнгеру в2005 году был разработан другой метод – секвенирование следующего поколения((Next Generation Sequencing, NGS) [137]. NGS аналогично секвенированию поСэнгеру в масштабах небольшого фрагмента ДНК. Особенностью NGS является то,что реакция протекает одномоментно на миллионах таких фрагментов.

Этопозволяет быстро секвенировать большую протяженность ДНК, охватывая целыегеномы. Стоимость единицы информации при NGS значительно ниже, нежели присеквенированию по Сэнгеру. Вероятно, в перспективе исследование целого гена спомощью метода NGS сравнится по стоимости с исследованием только частыхмутаций методом ПЦР, сделав последний неактуальным [204].Технически NGS протекает примерно следующим образом:1) ДНК фрагментируется на множество малых фрагментов (около 200 п.о.). Ихсовокупность составляет так называемую «библиотеку» сегментов.2) На матрице фрагментов достраиваются комплементарные им цепи3) Считывается последовательность новообразованных цепей4) Спомощьюсравненияпоследовательность гена.среференснымгеномомустанавливается48ДальнейшийанализидентифицированнойпоследовательностиДНКосуществляется с помощью различных компьютерных программ, а такжепроводится поиск мутаций и полиморфизмов с помощью различных баз данных(ресурсов wANNOVAR, Gene-Talk и др.).

В случае с диагностикой болезниВильсона-Коновалова также актуален поиск мутаций в базе данных университетаАльберты [211]. Выявленные изменения, не описанные в базах данных,подвергаются анализу с помощью программ-предикторов патогенности (SIFT,Polyphen-2, LTR, Mutation Taster и др.). Основной проблемой при анализе данныхNGS является вопрос интерпретации патогенности варианта. В случае, еслинаходка не была ранее описана в литературе, бывает затруднительно отнести ее кполиморфизмам или мутациям даже после анализа предикторами патогенности.Технология NGS отличается высокой масштабируемостью, и поэтому можетбыть использована для целевых (таргетных) исследований.

NGS позволяетодновременно секвенировать большое количество образцов. Чтобы достичь этого,к каждому образцу добавляют специальные метки, чтобы можно было ихдифференцировать в ходе анализа данных.Если до недавнего времени NGS использовалось в основном в научныхисследованиях, то в последние годы этот метод показывает свою эффективность ив клинической диагностике, в том числе и БВК.

В исследовании Poon Kok-Siongпроводилось таргетное NGS пациентам с БВК [164]. Авторы отметили, что этотметод показал себя быстрым, экономичным, эффективным и точным. Все мутации,выявленные с помощью NGS, были подтверждены секвенированием по Сэнгеру.Глубина покрытия гена ATP7B составила более 100 для всех анализируемыхобразцов.Несмотря на свою перспективность, NGS имеет ряд ограничений. Данныйметод не позволяет выявить геномные и хромосомные мутации, протяженныеделеции, дупликации и инверсии, случаи мозаицизма. Также могут бытьпропущены мутации в GC-богатых участках.49Таким образом, в данный момент наиболее частым генетическимисследованием, выполняющемся пациентам с БВК, является анализ частыхмутаций с помощью ПЦР.

Внедрение в практику NGS-метода в будущем позволитзначительно увеличить информативность исследования без существенногоувеличения стоимости.1.6.2.1 Генотип-фенотип корреляцияСмоментаустановлениягенетическойпричиныБВКмножествоисследователей ставят своей целью выявить корреляцию между конкретнымимутациями и особенностями клинической картины заболевания. В этомнаправлении достигнуты определенные результаты, однако они разрозненны, ивыявление мутаций пока не позволяет спрогнозировать течение заболевания сдостаточной степенью вероятности.Проблема в установлении генотип-фенотип корреляции может бытьобусловлена большим числом редких мутаций, которые встречаются лишь унескольких семей, и гетерогенностью клинических проявлений у больных БВКдаже среди членов одной семьи.