Диссертация (Оценка спектра мутаций гена ATP7B и клинического полиморфизма болезни Вильсона-Коновалова), страница 4

Изучение частоты остальныхмутаций в гене ATP7B при БВК проводилось ранее лишь на малых выборках вотдельных регионах России. Выявленный при этом спектр мутаций значительноварьировал в зависимости от национального состава населения. Так, в Хабаровскомкрае было проведено молекулярно-генетическое обследование 15 пациентов с БВК,мутация H1069Q выявлена у 10 пациентов в гомозиготном и у 3 – в гетерозиготномсостоянии[4].ВоВладивостокебылиобследованы57пациентовсневрологической формой БВК на наличие трех частых мутаций (D1267N, H1069Q,delC3402). В данной выборке преобладала мутация D1267N, которая обнаружиласьу всех обследованных больных, в то время как мутация H1069Q присутствовалалишь у 18,1% пациентов [19].

При исследовании в республике Башкортостанвыявлено 8 различных мутаций в гене АТР7В. Как и в других работах, снаибольшей частотой обнаруживалась мутация His1069Gln (55,5% аллелейрусского, 38,9% татарского, 44,4% башкирского и на 83,3% чувашскогопроисхождения). Впервые, у пациентов чувашского происхождения, обнаруженыдве ранее не описанные мутации: А1а718Рго и Lysl315Argl316delinsGlu, последняя21выявлена с высокой частотой (10,7%). Проводился анализ ассоциаций мутаций вгене АТР7В с гаплотипами по полиморфным ДНК-локусам (D13S316, D13S133,D13S228) [15].Подробное распределение мутаций в различных регионах показано в таблице 2.Таблица 2.

Мажорные мутации в различных странах мираРегионРоссияЧастые мутацииp.His1069Gln (c.3207C<A)Восточнаяp.His1069Gln (c.3207C<A)Европа в целомДанияАвстрияp.His1069Gln (c.3207C<A)p.Trp779* (c.2336G<A)p.His1069Gln (c.3207C<A)p.Gly710Ser (c.2128G<A )p.Met769fs (c.2298_2299insC)Частота35-50%15-72%, всреднем ~40%Источник[13, 15, 142]16-18%[144]3,6-34,1%[76][87]Болгарияp.His1069Gln (c.3207C<A)55,8%[190]Канарскиеостроваp.Leu708Pro (c.2123T<C)64%[82]p.His1069Gln (c.3207C<A)Континентальнp.Val845fs (c.2530delA 9)ая Италияp.Met769fs (c.2298_2299insC)c.-441_-427delСардинияp.Met822fs (c.

2463delC)Испанияp.Met645Arg (c.1934T<G)Нидерландыp.His1069Gln (c.3207C<A)p.His1069Gln (c.3207C<A)Польшаp.Ala1135fs (c.3400delC)p.Gln1351* (c.4051C<T)p.Arg778Leu (c.2333G<T)Китайp.Pro992Leu (c.2975C<T)p.Thr935Met (c.2804C<T)p.Arg778Leu (c.2333G<T)Кореяp.Asn1270Ser (c.3809A<G)p.Ala874Val (c.2621C<T)p.Asn958fs (c.2871delC)Японияp.Arg778Leu (c.2333G<T)c.1708-5T<Gp.Arg778Trp (c.2333C<T)Севернаяp.Ile1102Thr (c.3305T<C)Индияp.Pro992His (c.2975C<A)6-17,5%[129]8,5-66%[84, 128]27%33%[138][182]3,7-72%[89]3.3%-55%[53, 122,203]9,4-37,9%[205]10,5-18%9-19%[154, 188][92, 117]22Южная ИндияВосточнаяИндияЗападнаяИндияСаудовскаяАравияИранЕгипетСШАБразилияp.Ala1003Val (c.3008C<T)p.Cys271* (c.813C<A)p.Pro768Leu (c.2303C<T)p.Arg969Gln (c.2906G<A)p.Gly1061Glu (c.3182G<A )c.1708-1G<Cp.Cys271*(c.813C<A)p.Glu122fs(c.365_366delinsTTCGAAGC)p.Thr977Met (c.2930C<T)p.Leu795Phe (c.2383C<T)p.Gln1399Arg (c.4196A<G)p.Ser774Arg (c.2230T<C)p.His1069Gln (c.3207C<A)c.3904-2A> G18-2A<Gp.His1126fs(c.3373_3377delinsTCT)p.His1069Gln (c.3207C<A)p.His1069Gln (c.3207C<A)p.Asn1270Ser (c.3809A<G)p.Gly1266Arg (c.3796G<A)p.Ala1135fs (c.3402delC)p.Leu708Pro (c.2123T<C)11%11%9%9%11%8,5%20%32%16%19%[175][91][92][134][207]5,6-7%[30, 31]35-40%[87, 119]25-31%[63, 87]В зависимости от расположения и типа мутации может варьироваться еевлияние на функциональность итогового белка и, соответственно, на итоговуюклиническую картину.

Li X.H. et al. в своей работе приводят схематичноераспределение мутаций по длине гена (рисунок 1) [122].Рисунок 1. Распределение по гену ATP7B мутаций, выявленных приобследовании китайских больных с БВК.23Большинство из мутаций, включая мажорную His1069Q, приводят как кнарушению выведения меди в желчь, так и к нарушению связывания ее сцерулоплазмином. Однако, при мутации G943S страдает лишь выведение меди вжелчь, а связывание ее с церулоплазмином остается нормальным [78, 179].Исследования Huster D. et al. показали, что около 25-30% мутаций приводятлишь к частичной инактивации АТР7В.

Белковый продукт при этом способен ксвязыванию и гидролизу АТФ и сохраняет частичную способность к выведениюмеди. Это может объяснить легкое течение с более поздним началом заболеванияБВК у ряда больных [104].Мутации, являющиеся причиной БВК, также могут приводить к нарушениюлокализации или перемещения белка в клетке.

В норме ATP7B локализуется вкомплексе Гольджи, и при повышении уровня меди выходит оттуда в составепузырьков. Мутации могут вызвать задержку белка в эндоплазматической сети(ЭПС) и сбой его транспортировки к комплексу Гольджи [131]. Тем не менее, внекоторых случаях эта задержка может быть обратимой [94].Braiterman L.T. et al. наблюдали пациента с мутацией S653Y, которая неприводит к нарушению транспорта меди, но не позволяет белку выйти изкомплекса Гольджи. С помощью молекулярного динамического моделированияони предположили, что эта мутация вызывает локальное изменение конформациив трансмембранном домене 1 и изменяет его взаимодействие с трансмембраннымдоменом [44, 45, 104].Для АТФ-азы 7В характерен тканеспецифичный альтернативный сплайсинг,причем в клетках головного мозга встречается значительно больше вариантовбелка, чем в гепатоцитах.

Большинство транскриптов в печени содержат полныйнабор экзонов, соответствующий геномному. В вариантах белка, синтезирующихсяв головном мозге, могут отсутствовать экзоны 6, 7, 8, 12 и 13 [198]. Очевидно, чтоэффект мутаций, находящихся в вырезанных в процессе сплайсинга экзонах, непроявится.

Однако, возможна и обратная ситуация. Интересную молекулярногенетическую картину при мутациях сайта сплайсинга описали Mameli E. et al.24[136]. Ее суть состоит в том, что делеция 3039 пар оснований, затрагивающая часть1 интрона и 2 экзона, привела к потере основного сайта сплайсинга. При этомпроизошла активация вторичного, спящего сайта сплайсинга. Результатом сталовключение в первичный транскрипт интронной области с ранее молчащей нонсенсмутацией (стоп-кодон TAG).

Это привело к обрыву считывания и отсутствиюфункционального протеина (рисунок 2).Рисунок 2. Схема формирования дефектного белка при отдельной мутации сайтасплайсинга.Для БВК описано явление однородительской изодисомии (состояние, когдаобе хромосомы из пары хромосом у индивида с нормальным числом хромосомунаследованы только от одного родителя). В исследовании Coffey A.J. et al. былпротестирован 181 пациент с БВК и выявлено два случая однородительской дисомии[54].1.4.2. Патогенез БВКБВК связана с нарушением метаболизма меди, которая выполняет широкийдиапазон важнейших функций.

Способность атома меди служить и донором, иакцептором электронов, меняя степени окисления между Cu2+ и Cu+, делает медь25оптимальным кофактором для ферментов [187]. Примеры медьзависимых белковприведены в таблице 3 [133, 192].Таблица 3. Медьзависимые ферментыБелокЦерулоплазминЦитохром C оксигеназаДопамин-β-гидроксилаза(допамин-βмонооксигеназа)ГефестинГенCP13различныхгеновDBHФункцииОсновная ферроксидаза кровиСостоит из 13 субъединиц, составляющихмитохондриальныйоксидативныйкомплекс фосфорилирования IVСинтезе катехоламиновHEPHТранспорт железа из тонкого кишечникав кровьКатализируетоксидативноедеаминирование аминогрупп лизина игидроксилизинавбелкахпредшественниках коллагена и эластина.Катализирует превращение гомоцистеинав метионинОсновной антиоксидант цитоплазмыЛизил-оксидазаLOXМетионин-синтазаMTRСупероксид дисмутазаSOD1Средний взрослый человек употребляет с пищей 0,6-1,6 мг меди в сутки [124].Значительное количество меди содержат орехи, зерновые, бобовые, морепродукты,субпродукты, шоколад, грибы.

40-60% потребляемой меди всасывается из пищи, восновном, в двенадцатиперстной кишке, а также, в меньшей степени, в желудке ив дистальной части тонкой кишки. Медь из организма выводится через желудочнокишечный тракт, либо с помощью желчи, либо как не всосавшаяся медь. Только10-15% меди в желчи реабсорбируется. Избыток меди выводится с калом, как ввиде абсорбированных и неабсорбированных ионов металлов, так и с желчью, всреднем 0.5-1.3 мг в день, и в небольших количествах с мочой, слюной и потом[101]. При смещении равновесия между поступлением и выведением медизапускаются патологические процессы, лежащие в основе БВК [160].

Происходитблокирование свободной медью SH-группы глутатиона и многих ферментов,участвующих в окислительно-восстановительных реакциях, что приводит кэнергетическому голоданию [52].26В печени это приводит к жировой дистрофии и некрозу гепатоцитов,воспалению, фиброзу, пролиферации желчных протоков и циррозу, а в головноммозге – к некрозу нейронов с образованием полостей (кист) [1, 177].

Метаболизммеди представлен на рисунке 3.Рисунок 3. Метаболизм меди.В апикальной мембране энтероцитов на медь воздействует редуктаза,которая переводит пищевую медь Cu (II) в Cu (I). Медь со степенью окисления +1переносится в клетку с помощью человеческого медь-транспортирующего белкаhCTR1 и переносчика двухвалентных металлов DMT1 [46]. Последний помимомеди транспортирует также другие двухвалентные металлы: железо и цинк.Предполагается, что между ионами меди, железа и цинка может возникатьконкуренция за связывание с переносчиком при их одновременном присутствии впросвете кишечника [69]. hCTR1 обеспечивает биодоступность меди: при егоинактивации в энтероцитах накапливается биологически недоступная медь,которая не может служить кофактором для энзимов и не может связываться сдругими транспортерами [93].27Белок ATP7A транспортирует медь от апикальной к базальной мембранеэнтероцита и выводит в кровеносные сосуды [113].В кровотоке ионы меди Cu (II) связываются с альбумином, транскупреиноми образует низкомолекулярные комплексы с гистидином.

С током крови медьдостигает печени и транспортируется hCTR1 внутрь гепатоцитов [107]. Вцитоплазме гепатоцитов медь может задействоваться в нескольких направлениях:1) Депонирование меди в связанном с металлотионенами состоянии (в печенихранится большая часть меди в организме).2) Связывание меди с медными шаперонами (CCS, COX17 и ATOX1), которыедоставляют ее к медьзависящим белкам. В частности, CCS переносит медь кSOD1, а COX17 – к цитохром-Соксидазе. Способность атома меди менятьстепени окисления между Cu2+ и Cu+, позволяет ей эффективно участвовать вокислительно-восстановительных ферментативных реакциях.ШаперонATOX1 обеспечивает доставку меди к ATP7B, находящемуся в комплексеГольджи [77].3) Связывание с глутатионом (блокирование медью SH-группы).