Диссертация (1174310), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Технология Illuminaоснована на массивном параллельном секвенировании миллионов одноцепочечныхфрагментов ДНК (образующих колонии молекулярных кластеров) с помощьюфлуоресцентно-меченных нуклеотидов, комплементарно встраивающихся врастущую вторую цепь. Дизайн панели зондов, комплементарных одной цепи ДНК,осуществляется в программе DesignStudio (Illumina). Для подготовки библиотекиспользовался набор Nextera DNA Sample Preparation Kit (Illumina).К концам геномной фрагментированной ДНК (200 нг) были лигированыспецифические адаптеры (KAPA Library Preparation Kit и SeqCap Adapter Kit;Roche), после чего был проведен двухэтапный отбор фрагментов в диапазоне длин200-350bp с использованием магнитных частиц AMPure XPBeads (BeckmanCoulter).
Полученные фрагменты были амплифицированы с помощью праймеров,специфичныхкадаптерам,игибридизованысбиотинилированнымиспецифическими зондами (Nimble GenSeqCap EZChoiceHG38_CysFib_EZ_HX3;Roche) в течение 28 часов при температуре 47°С. В одной реакции былиобъединены 24 ДНК-образца с разными индексами адаптеров (А1-А16, А18-А23,А25, А27). Биотинилированные гибриды зондов-ДНК были выделены и очищеныстрептовидиновыми конъюгированными магнитными частицами, проведенавторая амплификация и качественная оценка полученной ДНК-библиотеки(TapeStation 4200; Agilent Technologies). С целью удаления нецелевых фрагментовамплификации и димеров адаптеров ДНК-библиотека была повторно очищена сиспользованиеммагнитныхчастицAMPureXPBeads.Оценкаконечнойконцентрации приготовленной библиотеки была проведена на приборе Quantus сиспользованием коммерческого набора QuantiFluor® dsDNA System (Promega).55Полученная ДНК-библиотека была иммобилизирована на поверхность проточнойячейки, после чего проводилось секвенирование на платформе Illumina сиспользованием проточной ячейки Standard FlowCell и реагентов MiSeq Reagent Kitv2 300 (2x150 cycles) (рисунок 5) [137].Рисунок 5.
Схема проведение NGS на платформе IlluminaДляинтерпретацииполученныхданныхиспользовалиськритерии,предложенные в Руководстве по интерпретации данных, полученных методамиMPS (2017) [25]. Выявленные варианты классифицировались как патогенные,вероятно патогенные, неопределенного значения, вероятно доброкачественные идоброкачественные.Кроме этого, использовалась база данных мутаций гена ATP7B УниверситетаАльберты [211].Вариантрассматривалсякакпатогенный,еслиобнаруживаласьсоответствующая информация о нем в различных базах данных и литературныхисточниках.
В том случае, когда упоминания варианта отсутствовали в научныхисточниках, он расценивался как патогенный, если удовлетворял следующимусловиям:- С низкой частотой встречался в крупных базах данных (EXAC, 1000G) [208,209],- относится к LOF (loss of function) вариантам – т.е. приводит к обрывусинтеза белка, сдвигу рамки считывания или изменению каноничных сайтовсплайсинга),56- относится к вариантам, приводящим к замене на ту же аминокислоту в томже кодоне, что и в ранее описанном в литературе патогенном варианте,- расценивается как патогенный программами предикторами патогенности(SIFT, Polyphen-2, LTR, MutationTaster и др.).Полимеразная цепная реакция (ПЦР).Для подтверждения 5-ти наиболее частых мутаций, выявленных методом NGS(c.2304dupC (p.Met769fs), c.3402delC (p.Ala1135fs), c.3649_3654 delGTTCTG,c.3190G>A(p.Glu1064Lys),c.3207C>A(p.His1069Gln)),использовалисьполимеразная цепная реакция (ПЦР) и ПЦР-ПДРФ анализ.1.ПЦР.100-250 нг исследуемого образца геномной ДНК добавляли к 25 мкл смеси, котораявключала 0,67 мМ трис-НСl, рН=8,8 при 25°С; 16,6 мМ (NH4)2SO4; от 1 до 6,7 мМMgCl2; 6,7 мкм ЭДТА; 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 170 мкг БСА, смесьдезоксинуклеотидтрифосфатов в концентрации 0,8 мМ каждого, термостабильнуюДНК-полимеразу 0,2 ед/мкл (“Сибэнзим”, Новосибирск) и каждого олигопраймера(таблица 6) до конечной концентрации 0,5 пмоль/мкл.
Реакцию проводили напрограммируемом амплификаторе Терцик («ДНК-Технология», Россия).Таблица 6. Праймеры для идентификации 5-ти частых мутаций.Вариантc.2304dupCc.3402delCc.3649_3654del6c.3190G/Ac.3207C/AПраймерыРазмерпродукта86 п.н.F: GTGGTTGCTGTGGCTGAGAAR: CCAGGGCAATGAACACAAAGF: CAGAGACAAAAGCCAGCAATACCT70 п.н.R: CACCGGCCAGTCACCTGAATF: CAATCGCAGACGCTGTCAAG124 п.н.R: ACCTGGGTGGCAATAGCTCTF: CGCCCAAGTCCACGTACCTC92 п.н.R: CTGGCTGTGGTGGGGACTCCF1: AGGGCAGCTAGGAGAGAAGGACA 254 п.н.
+R1: CGGAGGCCAGCAGTGAATAC137 и/илиF2: TGACTGCCACGCCCAAGAGT156 п.н. *R2: TGATGTTTGACAAGACTGGCACC57* Для идентификации частой мутации c.3207С/A применялся метод четырехпраймерной ПЦР. При постановке четырех-праймерной ПЦР наличие и отсутствиемутации можно определить по размеру продукта амплификации (внутреннийконтроль - 254 п.н., аллель С - 137 п.н., аллель А - 156 п.н.).2. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции.Для идентификации частой мутации c.3190G/A применяли метод гидролиза ДНКэндонуклеазами рестрикции.
С целью идентификации несинонимичной заменыc.3190G/A в гене ATP7Bбыла использована эндонуклеаза MspI:C↑CGGGGC↓CПри наличии мутации сайт рестрикции в исследуемом амплификате исчезает.Гидролиз амплифицированных фрагментов ДНК проводился согласнорекомендациям фирмы-изготовителя («Cибэнзим», Новосибирск). ПЦР-продуктыгидролизировали эндонуклеазами рестрикции при 37°C в течение 16 часов в 15 мклреакционной смеси, содержащей 5 мкл амплификата, 8,5 мкл воды, 1,5 мкл 10кратного буфера B (10 mM Tris-ацетат (pH 7.6 при 25°C); 10 mMMgCl2; 1 mM DTT)и 2-10 ед. (0,25-1,0 мкл) рестриктазы Msp I.
Полноту гидролиза оценивали порезультатам электрофореза в полиакриламидном геле.3. Электрофорез в полиакриламидном гелеПродукты амплификации и рестрикции разделяли в 7,5% полиакриламидном геле,приготовленном на трис-боратном буфере (ТБЕ) в аппарате для вертикальногоэлектрофореза с длиной стекла 20 см. Гель окрашивали в водном растворебромистого этидия (0,5 мкг/мл).
Результаты электрофоретического разделенияфрагментов ДНК регистрировали в проходящем ультрафиолетовом свете (длинаволны 320 нм) на трансиллюминаторе Macrovue (LKB, Великобритания).582.2.1. Методы статистической оценкиВ ходе исследования использовались стандартные методики статистическогоанализа.Для статистической обработки данных использован пакет прикладныхстатистических программ «IBM SPSS Statistics», а также программа MicrosoftExcel.Для оценки взаимосвязи между генотипом и клиническими проявлениямиБВК использовались критерий случайного распределения Пирсона (хи-квадрат), икоэффициент корреляции Спирмена [6].
Интерпретация значений коэффициенткорреляции проводилась согласно таблице 8.Таблица 8. Соответствие значения коэффициента корреляции силе взаимосвязиЗначение коэффициентаСила взаимосвязиот 0 до 0,3от 0,3 до 0,5от 0,5 до 0,70,7 и болееОчень слабаяСлабаяСредняяВысокая59ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ3.1. Общая характеристика больных основной группыДемографические характеристики обследованной группы представлены втаблице 8:Таблица 8. Демографическая характеристика пациентов с БВК.ОбщеепациентовПолпациентовколичество81мужской28,4%женский71,6%Средний возрастпациентов на моментобследования29,21±6,5 (от 8 до 68 лет)Средний возрастманифестации БВК18,57±6,4 (от 5 до 45 лет)Регион происхожденияЦентральный федеральный округ – 59 (73,4%)Дальневосточный федеральный округ – 3 (3,7%)Приволжский федеральный округ – 6 (7,4%)Северо-Западный федеральный округ – 2 (2,5%)Северо-Кавказский федеральный округ – 4 (4,9%)Сибирский федеральный округ – 1 (3,2%)Уральский федеральный округ – 3 (1,2%)Южный федеральный округ – 3 (3,7%)Неравномерность распределения пациентов по полу вероятно связана с тем,что мы наблюдаем в основном совершеннолетних пациентов, и предполагаем, чтосреди мальчиков ранняя смертность от проявлений БВК более высока.Первые клинические проявления болезни (манифестация) наблюдались ввозрасте от 5 до 45 лет, в среднем в 18,57 лет.
Распределение больных по возрастуманифестации представлено на рисунке 6.60Рисунок 6. Возраст пациентов на момент манифестацииВ 72,8% случаях пациент с БВК был единственным заболевшим в семье,однако существенная доля обследованных относится к семейным случаям БВК(27,2%). В 7,4% случаев БВК была диагностирована у пациента только послезаболевания сибса и его гибели из-за запоздалой диагностики (рисунок 7).7,4%СпорадическийслучайСемейные случаи72,8%Умер родственник27,2%19,6%Болен родственникРисунок 7. Семейные случаи БВК613.2. Общая характеристика контрольной группыХарактеристика контрольной группы представлена в таблице 9.Таблица 9.
Демографическая характеристика контрольной группыОбщее количество обследованных178Пол пациентовмужской74,2%женский25,8%Средний возраст в контрольной группе28,7±4,2 (от 22 до 35 лет)В связи с преобладанием обращения доноров сперматозоидов гендерныйсостав основной и контрольной группы отличается. Тем не менее, это не имеетсущественного значения в связи с тем, что БВК наследуется по аутосомнорецессивному типу и носительство мутаций в гене ATP7B не зависит от полаобследуемых.Представителиконтрольнойгруппыпрошлибазовоеклиническоеобследование, которое включало консультацию врача-генетика, терапевта,репродуктолога, психиатра, общий анализ крови и мочи, а также полноэкзомноесеквенирование.3.3.
Спектр и частота мутаций в гене ATP7B у пациентов с БВК и ихродственниковПроведено секвенирование гена ATP7B 81 пациенту с БВК, а также 10 ихближайшим родственникам первой степени родства (дети и сибсы пациентов).Обнаружен31патогенныйвариант.Переченьихарактеристикаобнаруженных патогенных вариантов, а также количество выявленных аллелейприведены в таблице 10.62Таблица 10.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
