Диссертация (1174310), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Тот факт, что большинство пациентов являютсякомпаунд-гетерозиготами, имеющими различные мутации на каждой копии гена,делает проблематичным связать фенотип с конкретной мутацией. Более того,показано, что профессионально обусловленное воздействие меди вызываетгеномные изменения и повреждение ДНК. Это, в комбинации с эпигенетическимимодуляторами и факторами внешней среды может играть важную роль вфенотипической гетерогенности у пациентов с БВК.
Эти затруднения могут бытьчастично преодолены изучением БВК у гомозиготных пациентов. Одной изнаиболее показательных работ с этой точки зрения является исследованиекрупнейшей ливанской семьи, где часты кровнородственные браки, наследованиемутаций в гомозиготной форме. Также плюсом исследования является то, чтобольшинство обследуемых проживало в примерно равных бытовых условиях иупотребляло сходную пищу [191]. В другой, более ранней работе была исследована50семья из 19-ти человек, где была обнаружена новая мутация T1288R у несколькихчленов семьи. Авторы предполагают возможную корреляцию мутации спеченочной манифестацией БВК [120].Shah A.B. et al. обследовали 109 пациентов с БВК североамериканскогопроисхождения и не нашли статистически достоверной корреляции генотипа свозрастом манифестации, формой БВК и лабораторными показателями [180].Liu, X.-Q.
et al. при изучении выборки китайских пациентов обнаружилиассоциацию мутации R778L с манифестацией БВК признаками поражения печени[127].В другом китайском исследовании была также отмечена связь данноймутациис более ранним возрастом манифестации инизким уровнемцерулоплазмина [53].Vrabelova S. et al. проанализировали мутации в гене ATP7B у 227 пациентовс БВК из 200 неродственных семей в Чешской республике и Словакии. Былоидентифицированоболее80%всехмутантныхаллелей.Наиболеераспространенной мутацией стала H1069Q (57%), также было обнаруженотринадцать новые мутаций.Авторы полагают, что для более экономичнойдиагностики в данном регионе достаточен скрининг всего пяти распространенныхмутаций, что поможет выявить 70% всех мутантных аллелей.
Однако, в даннойработе не было найдено значимой корреляции между гомозиготностью H1069Q,возрастом манифестации, клиническими и биохимическими проявлениями.Секвенирование гена ATP7B было проведено лишь тем нескольким пациентам, укоторых не дало результата исследование с помощью ПЦР [62, 195].Gromadzka G. et al. (2005) обследовали 142 польских пациента с БВК, исделали вывод об ассоциации нонсенс и фреймшифт мутаций с тяжелым течениеми ранним началом заболевания [89]. Prella M. et al.
в своем сообщении отметилиассоциацию гомозиготности по мутации Arg1319*, приводящей к обрыву синтезабелка, с гемолитической манифестацией БВК [167].Немецкие исследователи выявили ассоциацию мутации H1069Q с болеепоздним дебютом и более частой неврологической манифестацией БВК [47].51Аналогичные результаты показал метаанализ, выполненный Stapelbroek J. M. et al.[182].В Российской Федерации исследования генотип-фенотип корреляции приБВК проводились в отдельных регионах на небольших выборках пациентов.Например, в Приморском крае исследователям удалось собрать 127 пациентов,среди которых преобладающим было сочетание мутаций Gly1267Arg и DelC3402,однакоразбросклиническихданныхнепозволилустановитьискомойзакономерности [7].
В исследовании Магжановой А.Р. было проанализированооколо 60 пациентов и обнаружена ассоциация гомозиготности по мутации H1069Qс более мягким течением и поздним началом БВК [15].Постоянно производятся попытки установить корреляцию генотипа сфенотипом и при других моногенных заболеваниях. Одной из наиболее сходныхпо патогенезу наследственных болезней является наследственный гемохроматоз 1типа (НГХ). НГХ – одно из наиболее распространенных генетических заболеваний(встречается у 0,2-0,8% европейского населения) [18]. Описаны случаи сочетанияБВК с НГХ [200].
Для НГХ активно изучается генотип-фенотип корреляция, и ужеполучены убедительные данные об особенностях проявления отдельных мутаций[132, 165].Другими типичными примерами генетических заболеваний, для которыххарактерна явная генотип-фенотип корреляция, являются муковисцидоз ифенилкетонурия [43, 176].Таким образом, вопрос об установлении генотип-фенотип корреляции приБВК остается открытым, мнение различных исследователей касательно этойпроблемы противоречиво. Аналогичные исследования при других моногенныхзаболеваниях доказали важность изучения генотип-фенотип корреляции длядиагностики, определения тяжести течения и лечения редких заболеваний.52ГЛАВА 2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ2.1. Материалы исследованияМатериалом исследования явились 81 пациент с БВК и 10 их ближайшихродственников. Пациенты для проведения генетического тестирования былиотобраны по обращаемости для госпитализации в Клиникe ревматологии,нефрологии и профпатологии им. Е.М. Тареева в 2014-2015 гг.В группуобследования вошли как первично обратившиеся больные, так и длительнонаблюдающиеся и получающие терапию пациенты с установленным диагнозомБВК.В контрольную группу вошло 178 человек, не страдающих БВК и неимеющих отягощенного семейного анамнеза по данной патологии.
В качествегруппы контроля были обследованы доноры половых клеток (сперматозоидов ияйцеклеток) в ООО «ЦГРМ «ГЕНЕТИКО». В группе контроля не было выявленоникакихжалобневрологическогоилиабдоминальногохарактера.Вбиохимическом анализе крови не было повышения печеночных трансаминаз ибилирубина. При осмотре терапевта, невролога и психиатра патологии выявлено небыло. В семейном анамнезе у представителей группы контроля не было случаевБВК, неврологических заболеваний или цирроза печени неуточненной этиологии.2.2. Методы исследованияДлярешенияпоставленныхзадачбылииспользованыклинико-генеалогические, инструментальные и лабораторные методы обследования, в томчисле молекулярно-генетическая диагностика.
Диагноз БВК устанавливался всоответствии с Европейскими и Российскими клиническими рекомендациями, сиспользованием Лейпцигской балльной шкалы, а именно на основании данныхмолекулярно-генетического анализа гена ATP7B и клинической картины(печеночныеиневрологическиепоказателей обмена меди.проявления,кольцоКайзера-Флейшера),53Все пациенты прошли обследование, которые состояло из нескольких этапов:Этап 1.
Медико-генетическое консультирование, включавшее в себя сборклинического и семейного анамнеза, осмотр пациентов, объяснение им целиисследования и основ генетических особенностей БВК, расчет риска для детей всемьях пациентов. Все совершеннолетние участники подписали информированноедобровольное согласие на участие в исследовании. На участие в исследованиинесовершеннолетних обследуемых было получено согласие их родителей.Этап 2. Анализ клинико-лабораторных данных, полученных в процессестационарногонаблюдения.Былпроизведенретроспективныйанализинформации, содержащейся в историях болезни пациентов. Учитывались данныеклинического анализа крови и мочи, биохимического анализа крови (вобязательном порядке включающего в себя трансаминазы печени, липидныйпрофиль,показателиобменажелеза).Данныеанализыпроводилисьвмежклинической лаборатории ФГАОУ ВО Первый МГМУ им.
И.М. СеченоваМинздрава России (Сеченовский Университет). Всем больным было проведеноисследование показателей обмена меди (анализ проводился в ФГБНУ НИИмедицины труда имени академика Н.Ф. Измерова). Кроме того, все пациенты былиобследованы на наличие маркеров вирусных гепатитов B и C. Пациентампроводилось УЗИ брюшной полости, офтальмологическое обследование спомощью щелевой лампы. Инструментальные обследования выполнены всоответствующихотделенияхКлиникиревматологии,нефрологииипрофпатологии им.
Е.М. Тареева, ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. СеченоваМинздрава России (Сеченовский Университет).Этап 3. Молекулярно-генетическое исследование. Проводился заборпериферической крови в пробирки с ЭДТА. Выделение ДНК из лимфоцитовпериферической цельной крови проводилось с использованием набора QIAampDNA BloodMiniKit.С целью молекулярно-генетической диагностики БВК была разработанатаргетная NGS-панель, включающая ген ATP7Bи ряд потенциальных генов-54HFE,модификаторов:COMMD1,XIAP,CFTR,APOE,PRNP(NimbleGenSeqCapEZChoice: 151012_HG38_CysFib_EZ_HX3 (ROCHE)). Определениепоследовательности выбранных генов проводилось с использованием системывысокопроизводительного полногеномного секвенирования MiSeq SequencingSystem (Illumina). При этом исследовались все экзоны гена, а также фланкирующиепоследовательности интронов приблизительно на 50 п.о.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
