Диссертация (Оценка спектра мутаций гена ATP7B и клинического полиморфизма болезни Вильсона-Коновалова)

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕУЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ ПЕРВЫЙ МОСКОВСКИЙГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИИ.М. СЕЧЕНОВА МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙФЕДЕРАЦИИ (СЕЧЕНОВСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ)На правах рукописиБалашова Мария СергеевнаОЦЕНКА СПЕКТРА МУТАЦИЙ ГЕНА ATP7B И КЛИНИЧЕСКОГОПОЛИМОРФИЗМА БОЛЕЗНИ ВИЛЬСОНА-КОНОВАЛОВА03.02.07 – Генетика14.01.04 – Внутренние болезниДиссертация на соискание ученой степеникандидата медицинских наукНаучные руководители:доктор медицинских наук, профессорАсанов Алий Юрьевичдоктор медицинских наукИгнатова Татьяна МихайловнаМосква – 20182ОГЛАВЛЕНИЕВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………….……..4ГЛАВА 1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………..…………….…..121.1.Исторические аспекты изучения БВК………………….……..151.2. Классификация БВК………………………..………….………..161.3. Распространенность БВК………………………..…….………..161.4. Этиология и патогенез БВК…………………………………….181.4.1. Этиология БВК…………………………………………….181.4.2. Патогенез БВК……………………………………………..241.4.3. Факторы, модифицирующие течение БВК……………...331.5. Клиническая характеристика БВК……………………………….351.5.1. Поражение печени………………………………………...351.5.2.

Поражение нервной системы……………………………..371.5.3. Поражение других систем и органов при БВК………….381.5.4. Течение, прогноз и лечение БВК…………………………391.6. Диагностика БВК…………………………………………….……1.6.1. Биохимические и инструментальные методыдиагностики………………………………………………………411.6.2. Молекулярно-генетические методы диагностики……...461.6.2.1. Генотип-фенотип корреляция………………………….49ГЛАВА 2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ……………….…………………….522.1. Материалы исследования……………………..……………........522.2. Методы исследования………………………………………........532.2.1 Методы статистической оценки…………………………..58ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ…………………………….593.1. Общая характеристика больных основной группы…………....593.2. Общая характеристика контрольной группы………...………...3.3. Спектр и частота мутаций в гене ATP7B у пациентов с БВК иих родственников………………………………………………………613.4. Оценка гетерозиготного носительства мутаций в гене ATP7B вгруппе контроля………………………………………………………..3.5. Частота непатогенных вариантов в гене ATP7B у пациентов сБВК и их родственников и в группе контроля……………………….4161707033.6. Клиническая характеристика основной группы………………3.7. Трудности установления диагноза БВК в основной группепациентов……………………………………….………………………723.8.

Оценка течения БВК на медьэлиминирующей терапии ………803.9. Наблюдения коморбидности…………………………………...813.10. Оценка связи эффекта мутаций и тяжести течения БВК……..8976ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ…………………………………………….……. 96ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………………………………. 104ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………………………………………………….. 105ВЫВОДЫ………………………………………………………………..……106ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ………………………………..…… 108СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ…………………..…… 109СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………….……... 111ПРИЛОЖЕНИЕ 1…………………………………………………………….1344ВВЕДЕНИЕАктуальность темы исследованияБолезнь Вильсона-Коновалова (БВК, гепатоцеребральная дегенерация) – этонаследственное прогрессирующее заболевание обмена веществ, возникающеевследствие мутаций гена ATP7B.

При БВК происходит накопление меди в головноммозге, печени, глазах и других органах. В настоящее время известно около 7000наследственных заболеваний, и для большинства из них имеется лишьсимптоматическое лечение. БВК же принадлежит к тем немногим генетическимпатологиям, для которых разработана эффективная патогенетическая терапия.Внедрение медьэлиминирующей терапии Д-пеницилламином в клиническуюпрактику в 50-х гг. XX века позволило существенно увеличить продолжительностьи качество жизни пациентов с гепатоцеребральной дегенерацией.Постановлением Правительства Российской Федерации от 26 апреля 2012 г.№403«О порядкеведенияФедеральногорегистра лиц, страдающихжизнеугрожающими и хроническими прогрессирующими редкими (орфанными)заболеваниями, приводящими к сокращению продолжительности жизни гражданили их инвалидности, и его регионального сегмента» БВК включена в переченьорфанных заболеваний (код Е83.0).БВК встречается повсеместно, ее распространенность в среднем оцениваетсяв 1 на 30 тысяч населения, однако в последние годы появились сообщения осущественно более высокой частоте БВК.БВК возникает вследствие мутаций гена ATP7B, кодирующего белоктранспортер меди АТФазу-7В.

При БВК нарушается способность дефектнойАТФазы-7В к транспортировке меди в лизосомы и включению ее в церулоплазмин,в связи с чем снижается уровень церулоплазмина в крови и нарушается экскрециямеди с желчью.Для БВК характерно прогредиентное течение, широкая вариабельностьвремени манифестации и выраженная гетерогенность клинических проявлений (от5гепатита и цирроза печени до неврологическихрасстройств и другихвнепеченочных симптомов). Широкий спектр и неспецифичность наблюдаемыхсимптомов, а также низкая настороженность в отношении наследственнойпатологии среди специалистов амбулаторного звена ведут к тому, что диагностикаБВК зачастую запаздывает.Одним из методов, позволяющим установить диагноз БВК, являетсямолекулярно-генетическое тестирование.

К настоящему времени (2018 год) упациентов с болезнью Вильсона-Коновалова из большого числа популяций мираидентифицировано более 800 различных мутаций в гене АТР7В. В разныхэтнических группах спектр мутаций указанного гена у больных имеет своиособенности. Для Европы и европейской части населения России мажорноймутацией является H1069Q (p.His1069Gln) в 14 экзоне [13, 76, 116]. Показано, чтораспространенность данной мутации связана с эффектом основателя [112].Наиболее часто российские исследователи проводят поиск частых мутаций упациентов с БВК. Объем стандартного генетического исследования имееттенденцию к расширению.

Подбор частых мутаций сформирован на основанииисследования «горячих» экзонов гена АТР7В (14, 15, 16 и 18-й) у пациентов,происходящих в основном из европейской части России. Прямое секвенированиегена АТР7В до недавнего времени проводилось в крайне редких случаях, так какбыло сопряжено с большими финансовыми затратами. Современные возможностигенетического консультирования значительно расширились с появлением методовNGS (Next Generation Sequensing), которые обладают высокой информативностьюи существенно более низкой стоимостью. Проведение генетического тестированиядо того, как у пациента проявилась развернутая клиническая картина (в том числев рамках семейного скрининга), радикально упрощает диагностику БВК ипозволяет своевременно начать патогенетическую терапию.В мире неоднократно предпринимались попытки выявить корреляцию междумутациями гена АТР7В и клиническими проявлениями БВК.

В большинствеслучаев таковую установить не удалось. В некоторых случаях авторы сумели6выявить некоторые особенности течения БВК (более позднее начало, высокаячастота неврологических симптомов) у лиц, гомозиготных по наиболее частойсреди европейцев мутации H1069Q. Для других мутаций обнаружение такойкорреляции выглядит затруднительным в связи с тем, что большинство пациентовявляются компаунд-гетерозиготами, и проблематично набрать достаточнокрупную выборку больных с одинаковым генотипом по АТР7В. Некоторые авторыдля частичного решения этих проблем обращаются к изучению пациентов из семейс близкородственными браками. Такой подход позволяет изучить пациентов,гомозиготных по редким мутациям, и оценить их фенотип. Кроме того, в случаесравнения пациентов из одной семьи можно предполагать влияние на них сходныхвнешних воздействий.

В Российской Федерации исследования генотип-фенотипкорреляции при БВК проводились в отдельных регионах на небольших выборкахпациентов. Магжанова А.Р. отмечает в своем исследовании БВК в РеспубликеБашкортостан ассоциацию мутации H1069Q с более мягким течением и позднимначалом БВК [15]. Другим же исследователям при изучении этого вопроса неудалось установить искомой закономерности [7].Таким образом, спектр мутаций гена ATP7B в России требует дальнейшегоизучения с целью определения частоты известных мутаций и выявления новых,характерных для различных популяций. Метод таргетного NGS перспективен дляранней диагностики БВК, но необходимо оценить его эффективность вклинических условиях.

Актуально также изучение полиморфизма клиническойкартины БВК и потенциального влияния генотипа на клинические проявлениязаболевания. В комплексе это обеспечит научную базу для формированияперсонализированного подхода в ведении больного БВК.Научная новизнаВпервые проведено комплексное обследование российских пациентов с БВК,включающее поиск мутаций гена ATP7B методом NGS и всестороннее изучениеклинической картины; изучен клинический полиморфизм БВК, в том числевнутрисемейный.7Впервые в России проведено секвенирование гена ATP7B методомтаргетного NGS у 81 пациента с БВК. Секвенирование гена ATP7B позволиловыявить большое число уникальных редких мутаций, всего обнаружена 31различная мутация. Наиболее частыми мутациями явились c.3207C>A (48%аллелей) и c.3190G>A (7% аллелей).

Обнаружены 3 ранее не описанныепотенциально патогенные мутации - c.1870-8A>G, c.1971dupC, c.3036dupC.Информативность исследования составила 96%.Впервые проведено сравнение спектра патогенных и непатогенныхвариантов в гене ATP7B среди пациентов с БВК и в группе контроля (здоровыелюди).Впервые проведено исследование связи тяжести течения БВК с типоммутации с использованием группировки пациентов по принципу влияния мутациина белковый продукт.Цель исследованияОценить спектр мутаций гена ATP7B и проанализировать его возможнуюсвязь с развитием клинического полиморфизма при БВК.Задачи исследования1) На основании молекулярно-генетического исследования (таргетное NGS(Next generation sequencing)) определить частоту и спектр мутаций в гене ATP7B упациентов с БВК и их родственников.2) Оценить частоту гетерозиготного носительства мутаций в гене ATP7B вгруппе контроля с помощью полноэкзомного секвенирования методом NGS.3) Изучить особенности клинических проявлений у пациентов с БВК.4) Провести анализ связи тяжести течения с типом мутации и еепатогенетического эффекта.Практическая значимость исследованияРабота обосновывает значимость и перспективу внедрения современногомолекулярно-генетического метода исследования (таргетное NGS) для раннейдиагностики БВК.

Оценена эффективность метода для ранней диагностики БВК и8для медико-генетического консультирования семей больных с различнымиформами БВК. Данный подход позволяет выявить до 98% мутантных аллелей, чтопозволяетсвоевременнодиагностироватьзаболеваниеиназначитьпатогенетическую терапию. Это, в свою очередь, способствует улучшениюпрогноза для пациентов с БВК.Положения, выносимые на защиту:1.Большинство пациентов БВК компаунд-гетерозиготны. Наиболее частоймутацией в Российской популяции больных явилась мутация c.3207C>A(p.His1069Gln) - на 51,85% аллелей и у 72,9% обследованных.