Диссертация (Оценка спектра мутаций гена ATP7B и клинического полиморфизма болезни Вильсона-Коновалова), страница 11

Перечень и аллельные частоты мутаций гена ATP7B, выявленных при7Трансмембранный8ФосфатазныйТрансмембранныйФосфорилирующийТрансмембранныйАТФсвязывающий111314151617ВариантОписанаранее какпатогеннаяпри БВК6процент4c.331C>T(p.Gln111*)c.1630C>T(p.Gln544*)c.1870-8A>Gc.1969A>C(p.Ser657Arg)c.1971dupC(p.Met658fs)c.2121+3A>Gc.2128G>A(p.Gly710Ser)c.2293G>A(p.Asp765Asn)c.2304dupC(p.Met769fs)c.2332C>G(p.Arg778Gly)c.2336G>A(p.Trp779*)c.2605G>T(p.Gly869*)c.2998G>A(p.Gly1000Arg)c.3036dupC(p.Lys1013fs)c.3190G>A(p.Glu1064Lys)c.3207C>A(p.His1069Gln)c.3402delC(p.Ala1135fs)c.3556+1G>Tc.3098C>T(p.Thr1033Ile)Nвыявленныхаллелей2ЭффектМеталлсвязывающийЭкзонДоменобследовании основной группы пациентов.stop31,85%Даstop10,62%Даsplicing10,62%Нетmissense10,62%Даframeshift10,62%Нетsplicing10,62%Даmissense10,62%Даmissense10,62%Даframeshift84,94%Даmissense42,47%Даstop10,62%Даstop10,62%Даmissense10,62%Даframeshift21,23%Нетmissense148,64%Даmissense8451,85%Даframeshift106,17%Даsplicing10,62%Даmissense10,62%Да63c.3646G>A(p.Val1216Met)c.3649_3654delGTTCTG(p.Val1217_Leu1218del)c.3655A>T(p.Ile1219Phe)c.3659C>T(p.Thr1220Met)Фосфорилируc.3809A>G18ющий(p.Asn1270Ser)c.3948delG(p.Thr1317fs)Трансмембранc.3955C>T19ный(p.Arg1319*)c.3965G>C(p.Arg1322Pro)c.4022G>AС-конец(стабилизирую 20 (p.Gly1341Asp)щая функция)c.4125-2A>Gmissense10,62%Даindel74,32%Даmissense10,62%Нетmissense10,62%Даmissense10,62%Даframeshift10,62%Даstop10,62%Даmissense10,62%Даmissense10,62%Даsplicing42,47%ДаNGS позволил выявить мутации на обеих хромосомах у 96% и на 98%аллелей.

У 4% пациентов (2% аллелей) кандидатных мутаций не было обнаружено,несмотря на развернутую клиническую картину БВК.В большинстве случаев были выявлены две наиболее частые мутацииc.3190G>A (p.Glu1064Lys) и c.3207C>A (p.His1069Gln) в экзоне 14, которыевстретились, соответственно, на 8,64% и 51,85% аллелей. На третьем месте почастоте оказалась мутация c.3402delC (p.Ala1135fs) на которую пришлось 6,17%мутантных аллелей (рисунок 8).Мутация c.3207C>A (p.His1069Gln) обнаружилась у 72,9% обследованных.При этом только у 28,2% она присутствовала в гомозиготной форме, в то время каку остальных 44,7% обследованных данная замена была выявлена в компаундгетерозиготной форме.c.3402delC (p.Ala1135fs); 6,17%c.3649_3654delGTTCTG(p.Val1217_Leu1218del); 4,32%c.4125-2A>G; 2,47%другие мутации; 16,15%c.3207C>A (p.His1069Gln);51,85%c.2304dupC (p.Met769fs); 4,94%c.2332C>G (p.Arg778Gly); 2,47%c.3190G>A (p.Glu1064Lys); 8,64%Рисунок 8.

Спектр мутаций гена ATP7BСреди остальных мутаций только c.3190G>A(p.Glu1064Lys) обнаружилась вгомозиготной форме – у 1 пациентки. Таким образом, большинство пациентов(72,5%)оказалиськомпаунд-гетерозиготны,что,вцелом,совпадаетслитературными данными.В 16,15% случаев были обнаружены единичные редкие мутации гена ATP7B.Мутации c.1870-8A>G, c.3655A>T (p.Ile1219Phe), c.3036dupC (p.Lys1013fs)ранее не были описаны в литературе как приводящие к БВК. Вариант c.1870-8A>Gнаходится в каноничном сайте сплайсинга ирасценивается как патогенный программой fathmm-MKL. В этом положениив базе данных Университета Альберты описаны варианты c.1870-23A>C,c.1870-2A>G и c.1870-2delA. Вариант c.3655A>T (p.Ile1219Phe) приводит к замене изолейцина (относитсяк неполярным аминокислотам) на фенилаланин (относится к ароматическимаминокислотам).

Вариант рассматривается как патогенный программамиSIFT и Polyphen2b и как нейтральный программой PROVEAN. Вариант c.3036dupC (p.Lys1013fs) приводит к сдвигу рамки считывания. Вэтом положении в базе данных Университета Альберты описан вариантc.3036C>G, приводящий к образованию стоп-кодона и обрыву синтеза белка.Впоследствии планируется подтвердить наличие мутаций методом прямогоавтоматического секвенирования по Сэнгеру, а их патогенность – с помощьюсегрегационного анализа в семьях больных.По своему эффекту мутации распределились следующим образом: 14,0%аллелей - фреймшифт, 4,0% - нонсенс, 73,3% – миссенс, 4,7% – мутации сайтовсплайсинга, 4,0% - индел.Мутации обнаружились во всех экзонах гена ATP7B, кроме 1, 3, 5, 9, 10, 12 и 21. Нарисунке 9 представлено распределение выявленных патогенных вариантов поэкзонам и доменам гена ATP7B.Рисунок 9.

Распределение выявленных мутаций по гену ATP7B.Классически «горячими точками» гена считаются экзоны 14 и 15.Действительно, на большинстве аллелей присутствовали патогенные варианты в 14экзоне (96 аллелей). На втором месте по частоте были мутации в 8 экзоне (13аллелей), на третьем месте – в 15 и 17 экзоне (по 10 мутантных аллелей) (рисунок10).Тем не менее, наибольшее количество отдельных мутаций было обнаруженов экзонах 7, 8, 17 и 19, что позволяет также считать их «горячими точками» прианализе гена ATP7B (рисунок 11).

Большинство мутаций располагались в экзонах,кодирующих трансмембранный, фосфорилирующий и АТФ-связывающий доменыбелка.Проведеноподтверждениемутаций,которыевстречалисьсредиобследованных пациентов наиболее часто: c.2304dupC (p.Met769fs), c.3402delC(p.Ala1135fs), c.3649_3654delGTTCTG, c.3190G>A (p.Glu1064Lys), c.3207C>A(p.His1069Gln). Во всех случаях результаты подтверждающего тестированиясоответствовали результатам NGS.

У трех пациентов патогенных вариантов генаATP7B не удалось обнаружить с помощью NGS.В качестве родственников первой степени родства были обследованы 3супруга, три ребенка и четыре младших сибса пациентов с БВК. У всех нихотсутствовали клинические признаки БВК.

При обследовании родственников былиполучены следующие результаты:1.В 2 случаях семейный генетический скрининг выявил мутации вгомозиготной и компаунд-гетерозиготной форме у сибса пациента с БВК: умладшей сестры наблюдавшейся у нас пациентки были выявлены патогенныеварианты c.3207C>A(p.His1069Gln) и c.3190G>A(p.Glu1064Lys) гена ATP7B вкомпаунд-гетерозиготной форме; у младшего брата другой обследованной намипациентки была выявлена мутация c.3207C>A(p.His1069Gln) гена ATP7B вгомозиготной форме.2.В1случаебыловыявленоносительствоc.3207C>A(p.His1069Gln) в гене ATP7B у супруга пациентки с БВК.мутации12096100806040202113246713131113101011341819200814151617Рисунок 10.

Количество случаев выявления мутантных аллелей по экзонам.766554333222211124611115161107811131417Рисунок 11. Количество отдельных мутаций по экзонам181920При сравнении спектра выявленных в данном исследовании мутаций смутациями, входящими в наиболее часто применяющуюся в РФ панель, оказалось,что только 4 мутации из 12 встретились в обследованной выборке пациентов(c.2304insC, с.3207C>A, c.3402delC,c.3649_3654del6). Кроме того, еще 3 мутацииотносительно часто встречались среди наших пациентов, но не входили в даннуюпанель (c.2332 C>G (p.Arg778Gly), c.4125-2A>G, c.3190G>A (p.Glu1064Lys).Проведенное нами молекулярно-генетическое исследования методом NGSпоказало себя как высокоинформативный метод.

Расчетная информативностьразличных методов предоставлена в таблице 11.Таблица 11. Информативность в зависимости от объема генетическогоисследования.Объем исследованияТолько с.3207C>A12частыхмутаций:c.1340_1343del4,c.1770incT,c.2304insC,c.2532delCA,c.3026_3028delTCA, c.3029insT, c.3031insC,с.3207C>A,c.3402delC,c.3627_3630del4,c.3649_3654del6, c.[3942deLAT;3947deL]NGS гена ATP7BИнформативность, %По пациентамПо аллелям72,9%51,85%88,3%62,8%96%98%Примечание: Подчеркиванием в панели на частые мутации выделены те, которыебыли обнаружены в данном исследовании.

При расчете информативности попациентам учитывались случаи, когда мутация обнаруживалась хотя бы на однойкопии гена.Таким образом, метод таргетного NGS показал себя как эффективныйинструмент для поиска мутаций среди обследованных пациентов с БВК. Данныепо мажорной мутации c.3207C>A (p.His1069Gln), которая встретилась на 51,85%аллелей, в целом совпадают с данными других исследователей. Однако, второй почастоте оказалась мутация c.3190G>A (p.Glu1064Lys), которая ранее не включаласьв число частых. Обнаружилось значительное количество более редких мутаций, втом числе 3 ранее не описанные в литературе.703.4.

Оценка гетерозиготного носительства мутаций в гене ATP7B вгруппе контроляПри полноэкзомном исследовании в группе контроля было обнаружено 2случая гетерозиготного носительства мутации c.3207C>A (p.His1069Gln), чтосоответствует частоте носительства 1:89. Носительства других, более редкихпатогенных вариантов, выявлено не было.3.5. Частота непатогенных вариантов в гене ATP7B у пациентов с БВК иих родственников и в группе контроляВ таблице 12 представлены непатогенные варианты в кодирующих областяхгена, приводящие к несинонимичной замене аминокислоты.

Проанализированачастота вариантов, обнаруженных у пациентов с БВК, в крупных базах данных1000Genomes и ExAC, а также в группе контроля.Таблица 12. Частота непатогенных вариантов в основной и контрольной группе.Непатогенный вариантЧастотавариантав 1000GЧастотавариантав ExACc.3419T>C(p.Val1140Ala)0,5405350,565Частотавариантасредипациентов сБВК(N аллелей162)0,78c.2855G>A(p.Arg952Lys)0,530950,5620,79120,634831c.2495A>G(p.Lys832Arg)0,5023960,5370,780,626404c.1216T>G(p.Ser406Ala)0,3761980,4380,7030,550562c.1366G>C(p.Val456Leu)0,3769970,4340,76370,536517c.1373A>G(p.Glu458Gly)--0,016484-c.419C>G(p.Ala140Gly)--0,021978-c.409T>A(p.Ser137Thr)--0,021978-c.400C>G(p.Pro134Ala)--0,021978-0,0023960,0018960,0109890,002809c.4301C>T(p.Thr1434Met)Частотаварианта вгруппеконтроля(N аллелей356)0,64044971c.208C>A(p.Gln70Lys)c.3620A>G(p.His1207Arg)c.2956T>A(p.Ser986Thr)Таким--0,032967-0,031550,0260,0054950,014045--0,027473-образом,c.2855G>A(p.Arg952Lys),вариантыc.3419T>C(p.Val1140Ala),c.2495A>G(p.Lys832Arg),c.1216T>G(p.Ser406Ala),c.1366G>C(p.Val456Leu) относятся к часто встречающимся доброкачественнымнаходкам и обнаруживаются как в гомозиготном, так и гетерозиготном состоянии.В российской популяции частота данных полиморфизмов несколько выше посравнению с частотой в обследованных популяциях, данные по которымпредставлены в базах 1000Genomes и ExAC.Болеередкиевариантыc.4301C>T(p.Thr1434Met)иc.3620A>G(p.His1207Arg) встретились как среди наших выборок, так и в базах1000Genomes и ExAC с сопоставимой частотой.Данные по вариантам c.1373A>G(p.Glu458Gly), c.419C>G(p.Ala140Gly),c.409T>A(p.Ser137Thr),c.400C>G(p.Pro134Ala),c.2956T>A(p.Ser986Thr)отсутствовали в 1000Genomes и ExAC.

Кроме того, эти варианты не былиобнаружены при анализе данных секвенирования в группе контроля. Следуетотметить, что заключения программ предикторов патогенности по части этихвариантов имеют противоречивый характер, однако во всех случаях они быливыявлены при анализе данных пациентов, у которых уже были обнаруженыварианты с доказанной патогенностью (таблица 13).SIFTPolyphen2bfathmm-MKLc.419C>G(p.Ala140Gly)PROVEANВариантClinVarТаблица 13. Варианты с противоречивой оценкой патогенности-NeutralToleratedBenignPathogenic72c.400C>G(p.Pro134Ala)c.4301C>T(p.Thr1434Met)-NeutralToleratedBenignPathogenicConflictinginterpretations ofpathogenicityBenign/Likely benign-NeutralToleratedPossiblydamagingPathogenicc.3620A>GDeleterio Tolerated PossiblyPathogenic(p.His1207Arg)usdamagingc.2956T>ANeutralDamaging PossiblyPathogenic(p.Ser986Thr)damaging*Примечание: в связи с отсутствием единого мнения по поводу переводазаключений программ предикторов патогенности, было решено оставить их воригинальном виде.3.6.