Диссертация (Клинико-генетический полиморфизм синдрома некомпактного миокарда левого желудочка у российских больных), страница 9

Суммарная длина непокрытыхфрагментов, требующих дополнительного капиллярного секвенирования поСенгеру, составила 1310 bp.Секвенирование выбранной панели из 13 генов проводили методомполупроводниковогосеквенированиянаплатформеIonTorrent(LifeTechnologies). Методология секвенирования на платформе Ion Torrent основана напоследовательном удлинении олигонуклеотидной затравки ДНК-полимеразой содновременной регистрацией локального изменения рН на полупроводниковоммикрочипе. В приборе используются микрочипы, содержащие высокоплотнуюматрицу микроячеек для биохимических реакций. Каждая ячейка имеет датчик52ионов(pH-метр).Вкаждойячейкепроходитсеквенированиеодногомолекулярного клона ДНК путём синтеза комплементарной цепи ДНКполимеразой.

При встраивании полимеразой нуклеотида в молекулу ДНКпроисходит гидролизное отщепление трифосфата и высвобождение ионаводорода. Изменение pH фиксируется датчиком и преобразуется в сигнал. Привстраивании подряд сразу нескольких одинаковых нуклеотидов количествовысвободившихся ионов пропорционально увеличивается. По силе сигнала судято количестве встроившихся за один шаг одинаковых нуклеотидов.Таблица 3. Гены, вошедшие в Ampliseq-панель «Кардиомиопатии и синдромнекомпактного миокарда ЛЖ»№ГенКодируемый белокИсточник1MYH7β-тяжелая цепь миозина[36]2MYBPC3Миозин-связывающийбелок С[36]3TPM1α-1 цепь тропомиозина[67]4TNNT2Тропонин Т, миокард[36]5TNNI3Тропонин I, миокард[68]6TAZТафаззин[36]7MYL2Регулятормиозина 28MYL3Легкая цепь миозина 3[70]9ACTC1Белок семейства актинов[36]10LDB3(ZASP)LIM domain binding 3 (Z- [36]band alternatively splicedPDZ-motif)11LMNAЛамин А/С[71]12DTNAДистробревин-αOMIM: 604169легкойцепи [69]53Таблица 3.

Гены, вошедшие в Ampliseq-панель «Кардиомиопатии исиндром некомпактного миокарда ЛЖ» (продолжение)№ГенКодируемый белокИсточник13DESДесминOMIM: 604765Секвенирование выполнялось с использованием наборов готовых реагентовпо протоколу фирмы-изготовителя (Life Technologies). Пробоподготовку длясеквенирования на Ion Torrent проводили по протоколу фирмы (Life Technologies).Приготовление библиотек ампликонов проводили по следующей схеме(рисунок 5):Рисунок 5.

Схема пробоподготовки библиотек для секвенирования на платформеIon Torrent.Приготовление библиотек ампликонов включало в себя следующие этапы:541. Таргетнаяамплификацияучастков ДНКсиспользованием панелипраймеров Ampliseq.2. Частичная элиминация последовательностей праймеров3. Лигированиеампликоновимолекулярныхштрихкодов.Вслучаесеквенирования на одном чипе нескольких библиотек к каждой библиотекеприсоединяют молекулярный штрихкод (адаптер). Набор реагентов длялигирования включает в себя адаптеры IonXpress Adapters (форвардный иреверсный) в необходимой концентрации.4. Очистка библиотеки с использованием магнитных шариков, выравниваниеконцентрацийбиблиотекиоценкаконцентрациибиблиотексиспользованием флуориметра Qubit.Приготовленные библиотеки ампликонов смешивали в эквимолярномсоотношении.

Смесь библиотек наносили на чип прибора Ion Torrent всоответствии с протоколом фирмы-производителья.Результаты секвенирования считались достоверными, если покрытиесоответствующего участка гена составляло не менее 10 прочтений и целевойфрагмент был прочитан как с форвардного праймера, так и с реверсного.Все стабильно непокрываемые панелью области, а также области, имеющиенизкое качество покрытия у конкретных пациентов (< 10 прочтений) былиотсеквенированыметодомпрямогоавтоматическогодвунаправленногосеквенирования по Сенгеру.Выявленныеальтернативнымупробандовметодом–генетическиепрямымвариантыавтоматическимподтверждалидвунаправленнымсеквенированием по Сенгеру или ПЦР-ПДРФ анализом.2.5.3. ПЦР - амплификация исследуемых фрагментов ДНКДля избирательной амплификации кодирующих последовательностей иприлегающих интронных областей генов вошедших в Ampliseq-панель «Синдром55некомпактного миокарда левого желудочка», был проведен дизайн и синтезоригинальных олигопраймеров.Подбор праймеров осуществлялся с использованиеминтернет-ресурсовPrimerQuest и NCBI\Primer Blast.

Предварительный расчет температур плавленияосуществлялсяспомощьюпрограммPerlPrimerиPrimerQuest(http://www.idtdna.com/PrimerQuest). Специфичность выбранных пар праймеровоцениваласьспомощьюИнтернет-ресурсаNCBI\PrimerBlast.Условияамплификации впоследствии подбирались экспериментально.Визуализация результатов ПЦР проводилась методом электрофорезануклеиновых кислот в агарозных гелях различной плотности. Метод основан наразличной подвижности в геле молекул нуклеиновых кислот с разноймолекулярной массой под действием электрического поля.Для амплификации использовался автоматический амплификатор «Терцик»(ДНК-Технология, Россия). Очистка проб перед секвенированием проводилась сиспользованием смеси ферментов Exo-SAPIt согласно протоколу фирмыпроизводителя.2.5.4.

Прямое двунаправленное секвенирование по СенгеруСеквенированиепоследовательностиамплифицированныхфрагментовпроводилось на приборе Applied Biosystems ABI3730 XL согласно протоколуфирмы-производителя.Результатыпрограммыпрямого«Chromas2»секвенированияанализировались(htpp://www.technelysium.com.au).припомощиВкачествепоследовательности сравнения использовались референсные последовательностибазы данных NCBI RefSeq (hg19). Номера референсных последовательностей,которые использовались при анализе результатов секвенирования, приведены вТаблице 4.562.5.5. ПЦР-ПДРФ анализПодбор эндонуклеаз рестрикции для детекции конкретного генетическоговариантапроводилиспомощьюИнтернет-ресурсаhttp://www.restrictionmapper.org.Таблица 4. Номера референсных последовательностей (NCBI RefSeq) кДНКгенов MYH7, MYBPC3, TPM1, TNNT2, TNNI3, ACTC1, TAZ, MYL3, MYL2, LDB3(ZASP), LMNA, DTNA, DES которые использовались при анализе результатовсеквенирования№ГенИзоформаRefSeq)кДНК1MYH7NM_000257.32MYBPC3NM_000256.33TPM1NM_001018005.14TNNT2NM_001001430.25TNNI3NM_000363.46TAZNM_000116.47MYL2NM_000432.38MYL3NM_000258.29ACTC1NM_005159.410LDB3 (ZASP) NM_001080116.111LMNANM_170707.312DTNANM_001390.413DESNM_001927.3(NCBI57ПЦР-ПДРФ анализ осуществляли путем обработки амплифицированныхцелевых фрагментов ДНК соответствующей эндонуклеазой рестрикции попротоколу фирмы-производителя (НПО «СибЭнзим»).Анализ результатов проводили методом электрофореза нуклеиновых кислотв 2% агарозном геле или в 8% полиакриламидном геле.2.5.6.

Дополнительное секвенирование с учетом клинической картиныПри наличии у пациента данных в пользу определенного генетическогозаболевания проводилось таргетное секвенирование соответствующего генаметодом прямого двунаправленного секвенирования по Сенгеру.2.6. Секвенирование экзомаДля четверых пробандов и пятерых родственников было проведеносеквенирование экзома на платформе Ion Torrent. Для одного пробандасеквенирование экзома было проведено из-за подозрения на синдромальнуюпатологию; семьям двух пробандов с тяжелыми клиническими проявлениямизаболевания секвенирование экзома было предложено с учетом оценкицелесообразности секвенирования панели генов и дополнительного таргетногосеквенирования отдельных генов.

Еще в одной семье секвенирование экзома былопроведено с учетом отягощенного по повторным детским смертям семейногоанамнеза и запроса семьи на раннюю генетическую диагностику.Приготовление экзомных библиотек проводили с помощью методикиSeqCap EZ Target Enrichment System готовым набором для обогащения экзомов попротоколу фирмы (Roche).Потенциально патогенные генетические варианты подтверждались методомпрямого автоматического секвенирования методом Сенгера.Для трех семейпосле секвенирования экзома проводили каскадный семейный скрининг с цельютаргетного поиска потенциально патогенных генетических вариантов. Для одной58семьи было выполнено секвенирование экзомов обоих родителей, пробанда и трехсибсов.2.7. Биоинформатические методыПредварительнаяоценкафункциональнойзначимостивыявленныхнуклеотидных замен осуществлялась на основе биоинформатических Интернетресурсов: NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) Exome Variant Server (http://evs.gs.washington.edu/EVS/) HGMD (http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php) CardioClassifier (https://www.cardioclassifier.org/) NetGene2 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/) Splice Site Predictor (http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html) Polyphen2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) SIFT (http://blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html) PROVEAN (http://provean.jcvi.org/index.php) MutationTaster (http://www.mutationtaster.org/) InterVar (http://wintervar.wglab.org/)Оценкапотенциальнойпатогенностиобнаруженныхгенетическихвариантов проводилась в соответствии с Руководством по интерпретации данных,полученных методами массового параллельного секвенирования (MPS) от 2017года[73].Прианализепотенциальнойпатогенностииспользовалибиоинформатические ресурсы CardioClassifier и InterVar.

Генетическим вариантампо результатам анализа присваивались классы патогенности I-V.592.8. Оценка потенциального функционального значения генетическоговариантаДля пробанда, у которого был обнаружен генетический вариант,затрагивающийфункциональногосайтсплайсинга,значениявыполняласьгенетическогооценкаварианта.Быловозможногопроведеноисследование мутантной мРНК.Тотальную РНК выделяли из биоптата мышцы пробанда и его отца(контрольный образец) с помощью готового набора реагентов Quick RNA ZymoResearch по протоколу фирмы-производителя.

Мутантная кДНК была полученаметодом ПЦР с обратной транскрипцией с помощью готового набора реагентовPrimeScriptOneStepRT-PCR Kit попротоколу фирмы-производителя.Секвенирование мутантной кДНК проводили методом прямого автоматическогодвунаправленного секвенирования по Сенгеру.Последовательности олигонуклеотидных праймеров для реакции ПЦР собратной транскрипцией и для последующего секвенирования методом Сенгера,приведены в таблице 5.Таблица 5. Последовательности олигонуклеотидных праймеров для реакцииПЦР с обратной транскрипцией№НазваниеолигопраймераПоследовательность олигопраймера (5’-3’)13FGGAGATTCGGAGATGGCAG24-5RATCAGTACATGCTGACAGACAGAGAA336-37FACGGATGCCGCCATGAT439RACGAAGGGCTTGAATGAGGAG602.9. Статистический анализ полученных данныхДлястатистическогоанализаполученныхданныхиспользовалипрограммные пакеты SciPy и StatsModels языка программирования Python.Все количественные показатели были представлены в виде среднего иразброса максимального и минимального значений.