Диссертация (Влияние АКТГ4-7-ПГП (семакса) на морфофункциональное состояние гепатоцитов при различных видах стресса)

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждениевысшего образования«Курский государственный медицинский университет»Министерства здравоохранения Российской ФедерацииНа правах рукописиШЕПЕЛЕВА ОЛЬГА МИХАЙЛОВНАВЛИЯНИЕ АКТГ4-7-ПГП (СЕМАКСА) НА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕСОСТОЯНИЕ ГЕПАТОЦИТОВ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВИДАХ СТРЕССА14.03.06 – фармакология, клиническая фармакологияДиссертация на соискание ученой степеникандидата медицинских наукНаучный руководитель:доктор медицинских наук, профессорИ. И. БобынцевНаучный консультант:доктор медицинских наук, профессорА.

В. ИвановКурск - 20172ОГЛАВЛЕНИЕСтр.ВВЕДЕНИЕ……………………...……………………………………..4Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………..111.1 Современные представления о механизмах развития стресса……..111.2 Стрессиндуцированные изменения в печени и их механизмы……..141.3 АКТГ как регуляторный пептид семейства меланокортинов……...231.4 Физиологические и фармакологические эффекты АКТГ4-7-ПГП(семакса)……………………………………………….……………….25Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ……………………352.1 Экспериментальные животные……………………………………….352.2 Препарат……………………………………………………………..…362.3 Моделирование острого и хронического эмоционально-болевогостресса……………………………………………………….…………362.4 Моделирование острого и хронического иммобилизационногостресса….………………………………………………………………372.5 Выведение животных из эксперимента и забор биологическогоматериала………………………………………………………………372.6 Исследование показателей биохимического анализа сывороткикрови, характеризующих функциональное состояние печени……..382.7 Исследование показателей системы перекисного окисления липидов и системы антиоксидантной защиты…………………………….382.8 Морфологическое исследование печени…………………………….392.9 Статистическая обработка данных…………………………………..40Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ……………..413.1 Влияние пептида АКТГ4-7-ПГП (семакса) на морфофункциональное состояние печени крыс при эмоционально-болевомстрессе………………………………………………………………….413.1.1 Изменения биохимических показателей в сыворотке крови и гомогенизате печени на фоне введения АКТГ4-7-ПГП (семакса) вусловиях эмоционально-болевого стресса…………………………..413.1.2 Морфологические изменения печени при введении АКТГ4-7-ПГП513(семакса) в условиях эмоционально-болевого стресса……………..3.2 Влияние пептида АКТГ4-7-ПГП (семакса) на морфофункциональное состояние печени крыс при иммобилизационном стрессе..593.2.1 Изменения биохимических показателей в сыворотке крови и гомогенате печени на фоне введения АКТГ4-7-ПГП (семакса) вусловиях иммобилизационного стресса……………………………..593.2.2 Морфологические изменения печени при введении АКТГ4-7-ПГП(семакса) в условиях иммобилизационного стресса………………..703.3 Влияние введения АКТГ4-7-ПГП (семакса) на корреляционнуюзависимость функциональных и морфологических показателейпечени в условиях различных видов стресса………………………..783.3.1 Корреляционная взаимосвязь функциональных показателей печени и ее структурных изменений после введения АКТГ4-7-ПГП(семакса) в условиях острого эмоционально-болевого стресса……793.3.2 Корреляционная взаимосвязь функциональных показателей печени и ее структурных изменений после введения АКТГ4-7-ПГП(семакса)вусловияххроническогоэмоционально-болевогостресса………………………………………………………………….863.3.3 Корреляционная взаимосвязь функциональных показателей печени и ее структурных изменений после введения АКТГ4-7-ПГП(семакса) в условиях острого иммобилизационного стресса………943.3.4 Корреляционная взаимосвязь функциональных показателей печени и ее структурных изменений после введения АКТГ4-7-ПГП(семакса) в условиях хронического иммобилизационного стресса..102ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………………………..111ВЫВОДЫ………………………………………………………………128ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ………………………………130СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ……………………………………………131СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………….132ПРИЛОЖЕНИЕ 1……………………………………………………...1594ВВЕДЕНИЕАктуальность исследованияК настоящему времени в многочисленных исследованиях представлен полифункциональный характер биологических эффектов регуляторных пептидов,которые контролируют практически все физиологические функции организма.Данное обстоятельство способствовало созданию на их основе целого ряда фармакологических препаратов [59, 124, 130].

Одним из наиболее успешно реализованных проектов в данном направлении можно считать создание на основе синтетического аналога фрагмента АКТГ4-7 препарата семакс, который нашел широкоеприменение в клинике в качестве ноотропного и нейропротекторного средства[60, 78, 130].При этом отдельный интерес представляют экспериментальные данные обэффектах пептида в условиях стресса. В частности, семакс при хроническом введении предотвращал у крыс последствия непредсказуемого хронического стрессирования в виде повышенной тревожности, выраженности депрессивных компонентов поведения, снижения массы тела и увеличения относительной массынадпочечников [33]. Также установлено, что пептид оказывал защитное противотромботическое действие в условиях многократного иммобилизационного стрессаза счет повышения антикоагулянтной, суммарной и неферментативной фибринолитической активности, активности активатора плазминогена плазмы крови [40,48, 64].Известно, что стресс, являясь неспецифической адаптивной реакцией организма на действие различных раздражителей, с одной стороны, сопровождаетсясистемной перестройкой защитных механизмов, а с другой – может оказывать повреждающее действие на функциональные системы организма и вести к развитиюзаболеваний.

Одним из важных механизмов стрессорного повреждения тканей является увеличение продукции реактивных оксигенных радикалов, что сопровождается пероксидацией липидов клеточных мембран [234].При этом печень, которой принадлежит уникальная роль в регуляции постоянства внутренней среды организма, обладает высокой чувствительностью к5действию различных раздражителей, в том числе и стресса.

Важную роль в развитии стрессиндуцированных изменений в печени наряду с активацией процессовсвободнорадикального окисления играют ишемия, гипоксия и нарушения процессов микроциркуляции [172, 231, 254]. Известно, что семакс в культуре ткани оказывает выраженное антиоксидантное, антигипоксическое, ангиопротекторное инейротрофическое действие [17, 42].Учитывая вышеуказанную плейотропность эффектов препарата, а такжеособенности механизмов стрессорного повреждения печени, представлялось целесообразным изучение влияния семакса на структуру и функции печени пристрессорном воздействии.Степень разработанности темыСемакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro) является синтетическим аналогомфрагмента гормона АКТГ4-7, стабилизированным к действию экзо- и эндопептидаз присоединением к С-концу последовательности аминокислот Pro-Gly-Pro илишенным гормональной активности [2, 53, 98].Как и все регуляторные пептиды, данный препарат обладает полифункциональными эффектами, среди которых отмечается антиастеническое, антиамнестическое, антигипоксическое, анксиолитическое, ноотропное и нейротрофическоедействие [39, 75, 77, 79, 90, 102], что обусловливает его широкое использованиекак нейропротектора.

Помимо этого установлено, что препарат может обладатькак стресс-лимитирующим [19, 27, 33, 174], так и стресс-потенцирующим воздействием [23].Выявлено кардиопротекторное [6, 20, 47, 56], антигемолитическое [35, 36],антикоагулянтное [40, 48, 64], гастропротекторное [22, 84, 108] действие семакса.Однако изучения влияния препарата на функции гепатоцитов и структуру печенив условиях стресса до настоящего времени не проводилось.Диссертационноеисследование(№государственнойрегистрации01201254916) выполнено согласно основному плану научно-исследовательскойработы Курского государственного медицинского университета.6Цель работы – изучить влияние АКТГ4-7-ПГП (семакса) на морфофункциональное состояние гепатоцитов при иммобилизационном и эмоциональноболевом стрессах.Задачи исследования1.

Изучить влияние введения АКТГ4-7-ПГП (семакса) на изменение в сыворотке крови и гомогенате печени биохимических показателей функциональногосостояния гепатоцитов в условиях острого и хронического эмоциональноболевого стресса.2. Исследовать морфологические изменения печени после введения семаксав условиях острого и хронического эмоционально-болевого стресса.3. Изучить влияние введения семакса на изменение в сыворотке крови и гомогенате печени биохимических показателей функционального состояния гепатоцитов в условиях острого и хронического иммобилизационного стресса.4. Исследовать морфологические изменения печени после введения семаксав условиях острого и хронического иммобилизационного стресса.5.

Выявить корреляционные взаимосвязи показателей функционального состояния печени и ее морфологических изменений после введения семакса в условиях различных видов стрессорного воздействия.Научная новизнаВ работе впервые проведено комплексное исследование влияния АКТГ4-7ПГП (семакса) на механизмы перекисного окисления и антиоксидантной защитыв гепатоцитах, их протеинсинтетическую функцию, цитолитические и репаративно-восстановительные процессы. Установлено, что выраженность и направленность эффектов пептида зависят от величины используемой дозы, вида стрессорного воздействия и его продолжительности.Впервые определены дозы семакса, оказывающие наиболее выраженноевлияние на морфофункциональное состояние гепатоцитов в условиях иммобилизационного и эмоционально-болевого стресса.7Впервые с использованием корреляционного анализа изучено влияние семакса на взаимосвязи показателей морфофункционального состояния гепатоцитов в условиях различных видов стрессорного воздействия.Практическая значимость работыЭкспериментально показано влияние АКТГ4-7-ПГП (семакса) на морфофункциональное состояние гепатоцитов в условиях стресса, которое следует учитывать при использовании семакса в клинической практике, разработке патогенетически обоснованных методов коррекции стресс-индуцированных патологических сдвигов в печени, а также при разработке фармакологических препаратов наоснове пептидов семейства меланокортинов.На основании результатов исследования получен патент «Применение пептида АКТГ(4-7)-ПГП для гепатопротекторного воздействия» (патент на изобретение № 2528741 от 20.09.14 г.).Полученные данные расширяют существующие представления о роли регуляторных пептидов в организме, полифункциональном характере их биологических эффектов и плейотропности действия фармакологических препаратовна их основе.Мeтодология и мeтоды иccлeдовaнияМетодология исследования заключалась в изучении эффектов внутрибрюшинного введения пептида АКТГ4-7-ПГП (семакса) на показатели функционального состояния гепатоцитов, такие как активность цитолитических процессов,протеинсинтетическая функция, выраженность ПОЛ гепатоцитов, активность антиоксидантной системы и морфологическое состояние тканей печени, а именно:число одно- и многоядерных и одно- и многоядрышковых клеток, наличие дистрофических процессов.Cтeпeнь доcтовeрноcти и aпробaция мaтeриaлов иccлeдовaнияCтeпeнь доcтовeрноcти опрeдeляeтcя полнотой литературного обзора,доcтaточным чиcлом наблюдений (216 самцов крыc Виcтaр), рандомизированнымформированием интактных, контрольных и экспериментальных групп, общепринятыми методами оценки активности аминотрансфераз, концентрации сыворо-8точного белка, активности антиоксидантных ферментов и концентрации МДА,общепринятыми методиками получения гистологических препаратов и их морфометрической оценки, а также выбором и применением методов cтaтиcтичecкойобрaботки данных согласно типу их распределенияОсновные положения, выносимые на защиту1.

АКТГ4-7-ПГП (семакс) оказывает существенное влияние на морфофункциональное состояние гепатоцитов при различных видах стресса за счет влиянияна процессы перекисного окисления и механизмы антиоксидантной защиты в гепатоцитах, их протеинсинтетическую функцию, цитолитические и репаративновосстановительные процессы.2.