Диссертация (Блокаторы медленных кальциевых каналов новые возможности использования в качестве регуляторов образования соединительной ткани), страница 14

Первичной культуре мы отдалипредпочтение потому, что такие культуры наиболее чувствительны ко всемвнешним факторам, а клетки таких культур по своим фенотипическим игенотипическим характеристикам наиболее близки к соответствующим клеткамздоровогоорганизма.Первичнуюкультуруфибробластовимакрофаговоценивали по следующим критериям: клеточная однородность монослоя,внешний вид и жизнеспособность клеток, пролиферативная, биохимическая ииммунная активность клеток.

Для выделения клеток брюшную полость забитыхживотных дважды промывали 10 мл среды RPMI-1640, содержащей 25 ЕД/мл78гепарина, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 ЕД/мл стрептомицина. Образцыперитонеальных смывов центрифугировали при 800 об/мин в течение 10 минутдля осаждения клеточных элементов, которые затем трижды отмывали ростовойсредой: RPMI-1640 («Sigma») с добавлением 10% эмбриональной телячьейсыворотки, 2% глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 ЕД/мл стрептомицина.Количество клеток в среде определяли методом подсчета в камере Горяева идоводили концентрацию клеток до 2х106/мл.

Также подсчитывали числожизнеспособных клеток с помощью метода исключения красителя трипановогосинего. Полученные суспензии содержали 89-95% живых клеток. Затемсуспензию перитонеальных клеток, содержащую активированные фибробласты имакрофаги делили на четыре одинаковых пула, составляющих исследовательскиегруппы, и эксплантировали в чашки Петри диаметром 40 мм с покровнымистеклами, покрытыми синтетическим аналогом внеклеточного матрикса поли-Dлизином для адгезии клеток, в 5 мл полной ростовой среды вышеуказанногосостава по 2х106 ядросодержащих клеток на мл среды.

Клеточные культуры всехисследовательских групп инкубировалив среде для ростасодержанием СО2 на уровне 5 % в течение 24 ч.при 37оСв атмосфере сПо окончании культивирования средусливали, центрифугировали (1500 об/мин, 10 мин), супернатант разливали попорциям и хранили при -200С. Покровные стекла промывали в растворе Хенкса споследующей фиксацией и окрашиванием.Припроведении исследований на дермальных фибробластах человека(Human Dermal Fibroblasts (Adult) производства Axol Bioscience) культивированиепроходило по стандартной технологии в условиях абсолютной влажности, 37ºС,5% СО2. Использовали культуры с концентрацией клеток 2х106/мл. Культуруделили на несколько пулов и высевали в чашки Петри.Для стимуляцииактивности NF-kB культуру подвергали действию TNF-a (30 нг/мл, производства«Sigma»,Великобритания).1-ючашкукультивировалибездобавлениялекарственных средств (группа 1), во 2-ю добавляли раствор верапамила (2-ягруппа),в 3-ю - дилтиазема (3-я группа), в 4-юнифедипина (4-я группа).Использовали раствор верапамила 0,25% концентрации в ампулах по 2 мл79производства ОАО ―Биосинтез‖, г.

Пенза, Россия; раствор дилтиазема (DiltiazemHydrochloride Injection) производства компании Hospira во флаконах по 10 мл вконцентрации 5 мг/мл; раствор нифедипина (Адалат производства компанииBayer, Германия, во флаконах по 50 мл в концентрации 100 мкг/мл).

Контролемслужили клеточные культуры неактивированных дермальных фибробластов.После внесения в культуры БМКК чашки инкубировали в течение 24 часов. Вдвух параллельных исследованиях использовали разные дозы БМКК 0,00005 мл-1и 0,0001 мл-1. Приготовление ядерных экстрактов для определения содержанияNF-kB (р50/р65) в культурах как перитонеальных, такфибробластови дермальныхпроводилось в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя BCM Diagnostics (США).

Для выделения ядерной фракций клеткисобиралиипромывалихолоднымPBS,концентрироваликлеткицентрифугированием. Полученный осадок ресуспензировали в гипотоническомбуфере и инкубировали 15 минут на льду, затем добавляли детергент NP40 ицентрифугировали при 40С (3000 об/мин, 10 минут). Осадок суспензировали в 50мкл экстракционного буфера в присутствии ингибиторов протеиназ (30 мин) ицентрифугировали при 40С (13000 об/мин, 30 мин).

Супернатант (ядернаяфракция) собирали, замораживали и хранили до измерения при -800С.Определение содержания ядерного фактора NF- kB (p50/p65) в образцах лизатовклеток проводили методом иммуноферментного анализа с помощью фотометра«Multiscan» (Финляндия), используя наборы реагентов BCM Diagnostics (США).2.3.2. Морфологические и иммуноцитохимические методыПролиферативнуюактивностьфибробластовоцениваливобычномгистологическом исследовании по количеству клеток с морфологическимипризнаками митозов, а также по экспрессии в ядрах фибробластов маркерапролиферации Ki-67 - белка, экспрессирующегося на всех стадиях клеточногоцикла, кроме стадии G0.

Традиционный подсчет митотической активностинедостаточно отражает пролиферативный потенциал клетки, так как собственно80митоз занимает несколько часов (что может визуализироваться при рутинномисследовании), а подготовка к нему – около 24 часов, в связи с чем изучениенегистонового протеина Ki-67 (маркера пролиферации), экспрессирующегося вовсех клетках, вышедших из G0-фазы, позволяет определить "скрытый"пролиферативный потенциал фибробластов.Для определения пролиферативной активности фибробластов покровныестекла высушивали, клетки на них фиксировали 96% этиловым спиртом иокрашивали по Романовскому-Гимза.

Визуализацию проводили с помощьюбинокулярного светового микроскопа (Axioscop «Carl Zeiss», Германия).Увеличение: объектив х100, окуляр х10. Просматривали 400 клеток иподсчитывали среди них количество клеток с морфологическими признакамимитозов. Митотический индекс (MI) определяли по формуле: МI= n/Nх100%, гдеn – число клеток, вступивших в митоз, N – общее количество клеток.Иммуноцитохимическое исследование фибробластов выполняли по стандартнойметодике с использованием в качестве первичных антител МКА к Ki-67 («Sigma»,США) в разведении 1:20 и вторичных ФИТС-меченых козьих антител киммуноглобулинам мыши («Сорбент», Россия). В качестве контроля дляисключенияпрямогоиммуномечения(окрашивания)клетоквторичнымиантителами использовали вместо первичных антител фосфатно-солевой буфер(PBS).

Полученные препараты изучали с помощью люминесцентного микроскопа(Axiophot, «Carl Zeiss», Германия), применяя объективы х100/1,3 и окуляры х10 сподсчетомклеток,имеющихсветящиесяфокусывобластиядра,ипредварительной оценкой клеток при фазово-контрастной микроскопии.Исследование макрофагальной трансформации моноцитов проводили поДемченкоТ.А.(1980).Макрофагальнуютрансформациюопределяли при культивировании клеток in vitro,адгезированных наоценивалимононуклеаровс последующей окраскойстеклах клеток по Романовскому – Гимзе. Результатымикроскопически с подсчетом 400 мононуклеаров и определением впроцентах количества макрофагов, появившихся в культуре после 24-часовой81инкубации, которое иявлялось показателем макрофагальной трансформациимоноцитов.Макроморфологическое исследование включало оценку выраженностиспаечногопроцессавбрюшнойполости(распространенностьпроцесса,локализация спаек, их форма, деформация органов спайками, наличие выпота вбрюшной полости).

Морфологические изменения со стороны брюшины и органовбрюшнойполостифотографировались.оценивалисьвизуально,протоколировалисьиСпайки извлекались и подвергались гистологическомуисследованию по общепринятым методикам, используемым при световоймикроскопии, с окраской гематоксилином и эозином, а также пикрофуксином поВан Гизону.Проведено исследование 106 биоптатов кожи крыс. Для гистологическогоисследования брали по 3 фрагмента из центральной зоны биоптата и по 5-6фрагментов из периферической зоны. Кусочки фиксировали в 10% нейтральномформалине в течение 24-48 часов.

Далее материал обезвоживали, обезжиривали изаливали в парафин по общепринятой методике. С парафиновых блоков готовилисрезы толщиной 5-10 мкм по 5-6 срезов на 2-3 предметных стеклах. Срезыокрашивали гематоксилином и эозином (обзорная микроскопия с изучениемобщего плана строения ткани) и пикрофуксином по Ван Гизону (выявлениеколлагеновых волокон). Оценка микроскопических данных с морфометрическимисследованием (ГГ. Автандилов,1990) и последующим микрофотографированием,проводилась в световом микроскопе «Zeiss» (Германия).

Морфологическиеисследованиявыполненысовместносд.м.н.С.С.Степановым(кафедрагистологии, цитологии и эмбриологии ОмГМУ).2.3.3. Биохимические методыВ супернатантах клеточных культур иперитонеальной жидкостиопределяли содержание оксипролина и гиалуроновой кислоты. Содержаниеоксипролина, основного маркера коллагена, определяли по методике Шараева82П.Н. (1990). Содержимое свободного и суммарного оксипролина рассчитывали покалибровочной кривой и выражали в микромолях на 1 л.

По разности содержаниясвободного и суммарного оксипролина находили количество белковосвязанногооксипролина. Степень стимуляции коллагеногенеза фибробластами в культуреклеток оценивали по количеству белковосвязанного оксипролина. О синтезегликозаминогликанов фибробластами судили по концентрации гиалуроновойкислоты в культуральной и/или перинатальной жидкости.гиалуроновойкислотыопределялипокарбазольнойКоличествореакцииДишевмодификации Шараева П.Н. с соавт.

(1996).2.3.4. Иммунологические методыВперитонеальнойжидкостиэкспериментальныхживотныхсгемоперитонеумом (in vivo) и в ростовой среде культувируемых перитонеальныхклеток (in vitro) методом твердофазного иммуноферментного анализа определялисодержание провоспалительных цитокинов:фактора некроза опухолей альфа(TNF-) и интерлейкина-1 (IL-1). Анализ цитокинов осуществляли с помощьюнаборов Rat IL-1β и TNF- ELISA Development Kit (PeproTech, США) на ИФАридере Multiscan MS (Labsystems, Финляндия) в соответствии с протоколом,предложенным производителем.2.3.5.