Диссертация (Блокаторы медленных кальциевых каналов новые возможности использования в качестве регуляторов образования соединительной ткани), страница 18

В течение 24 часовТаблица9.Морфофункциональныепоказателиперитонеальныхмакрофагов (M±m)ПоказателиГруппы4-я8-я(активированные(неактивированныеклетки)клетки)МТМ, %60,5±3,1*24,1±5,2TNF-, пг/мл321,3±21,1*17,1±1,8IL-1, пг/мл54,4±4,2*14,9±2,1Примечание: * - достоверность различий между группами, p<0,05.культивирования 60,5 ± 3,1% из них дифференцировалось в макрофаги, что в 2,5раза превышало показатели 8-й группы сравнения. Следствием активациимакрофагов при моделировании асептического воспаления брюшины являетсяусиленная секреция ими цитокинов, прежде всего провоспалительного характера:TNF- и IL-1. Наиболее выраженные отклонения регистрировались приопределении количества TNF-, которое превышало контрольные значения в 19раз (табл.9).Это согласуется с имеющимися данными о биологических свойствахданного цитокина, обего участии в процессах деструкции и репарации,107сопутствующих воспалению, способности TNF- индуцировать пролиферациюфибробластов и синтез коллагена при активации фиброгенеза на этапахзавершения воспаления [118].

Известно, что высокая концентрация TNF- влечетза собой хроническое воспаление, способствует неблагоприятному течениюпатологического процесса и является ключевым фактором в развитии спаечнойболезни[240].НарядусусилениемвыработкиTNF-,вкультуреактивированных клеток 4-й группы наблюдалось изменение уровня IL-1, котороедостигало 3,6- кратного увеличения по сравнению с 8-й группой сравнения(табл.9, рис. 9).

Известно, что IL-1 индуцирует пролиферацию фибробластов итакие изменения их функционирования, которые способствуют развитию фиброза[118, 225, 226].Таким образом, в результате проведенных экспериментов выявлено, чтопри развитии спаечного процесса в брюшной полости через 10 дней послемоделированиягемоперитонеума,наблюдаласьчрезмернаяактивацияперитонеальных фибробластов и усиление функциональной активности клетокмикроокружения- макрофагов при совместном их культивировании in vitro.Активация фибробластов реализовалась 5,3-кратным увеличением митотическойактивности клеток (р<0,05), 8-кратным ростом количество Ki-67+ клеток (р<0,05),синтеза ими основных компонентов межклеточного матрикса соединительнойткани: 4,2-кратным повышением уровня оксипролина (р<0,05) и 3-кратным гиалуроновойкислоты(р<0,05).Избыточнаяактивностьмакрофаговпроявлялась 2,5-кратным ростом макрофагальной трансформации моноцитов(р<0,05), 19-кратным увеличением количества TNF- (р<0,05), 3,6-кратным - IL-1(р<0,05).

Увеличение в ходе асептического воспаления брюшины количестваактивированныхфибробластов,обладающихвысокимпролиферативнымпотенциалом с морфологическими признаками митозов и гиперэкспрессией Ki67,является одним из ключевых звеньев избыточного формированиясоединительной ткани, обусловливающего выраженное и распространенноеспайкообразование в брюшинной полости крыс при гемоперитонеуме.1084.2. Сравнительная оценка классических блокаторов медленныхкальциевых каналов верапамила, дилтиазема и нифедипина вкачестве регуляторов функции перитонеальных фибробластови макрофагов; дозозависимый эффектИсследования, проведенные во II серии экспериментов по определениюдозозависимого влияния БМКК (верапамила, дилтиазема, нифедипина) накультуру активированных фибробластов и макрофагов, выявили, что добавлениеверапамила к культуре клеток (5-я группа) предотвращало чрезмерную активациюфибробластов и клеток моноцитарно-макрофагального ряда (табл.10).

Введениеверапамила в культуру клеток (5-я группа) в концентрациях 0,00005 мл-1 и 0,0001мл-1 предотвращалочрезмернуюактивациюфибробластов:митотическаяактивность клеток при добавлении верапамила снизилась на 33,3% и 58,5%,составляя 66,7% и 41,5% соответственно от уровня активированных культур (4-ягруппа - контроль) без лекарственных средств (табл. 10, рис. 10.р<0,05),количество Ki-67+ клеток, экспресирующих маркер пролиферации, напрямуюсвязанный с делением клетки, белок Ki-67уменьшилось на 39,0% и 59,2%,составляя 61,0% и 40,8% соответственно от уровня активированных культур безлекарственных средств (табл.10, р<0,05).

Верапамил, введенныйв культуруперитониальных клеток, уменьшал гиперпродукцию коллагена активированнымифибробластами. Количество белковосвязанного оксипролина, синтезируемогофибробластами в культуральной жидкости с верапамилом (5-я группа), было на66,7% ниже, чем в культуре клеток без добавлении лекарственных средств (4-ягруппа; табл.10 рис.10).Вприсутствииверапамилавкультуральнойсредеколичествогиалуроновой кислоты через 24 часа инкубации также было ниже (5-я группа),чем в контроле (4-я группа). Добавленный к культуре активированныхфибробластов верапамил останавливал наработку гиалуроновой кислоты науровне 61,3% от показателей в культуре активированных фибробластов109МИОПКГМТМTNF-αIL-10%-10%-20%-40%**-30%*0,5 мг/мл**1,0 мг/мл*-50%**-60%**-70%**-80%Рисунок 10.

Влияние верапамила на морфофункциональные показателиперитонеальных фибробластов и макрофагов (процент снижения от уровняконтроля). * - p<0,05без добавления лекарственных средств (табл.10, рис., р<0,05 ). Степень сниженияуровней данных веществ была более значима при концентрации препарата 0,0001мл-1 (табл. 10, рис.10).Дозозависимыйэффект действияверапамила на культуру клетокобнаружен и при исследовании степени трансформации моноцитов в макрофаги.Болеезначимоеторможениечрезмернойпролиферациимоноцитовпрослеживалось в концентрации 0,0001 мл-1 (табл.11, рис.10).Исследование уровней TNF- и IL-1 выявило, что введение в культуруклеток верапамила в концентрации 0,00005 мл-1 предотвращало повышениенаработки данных цитокинов на уровне менее значимом, чем при использованиибольшей (0,0001 мл-1) концентрации вещества (табл.11, рис 10).110Таблица 10.

Влияние верапамила на морфофункциональные показателиперитонеальных фибробластов (M±m)ПоказателиКонтрольВерапамил (конц.)0,00005 мл-10,0001 мл-18,2±0,3*5,1±0,1*^Ki-67+ 32,6±0,7*19,9±0,4*13,3±0,6*^26,7±1,712,6±0,9*8,9±0,2*^1,6±0,121,2±0,1*0,98±0,05*МИ фибробластов, 12,3±0,4%Количествоклеток, %Оксипролин,мкмоль/лГиалуроноваякислота, ммоль/лПримечание: * - достоверность различий между 5-й группой (верапамил),и контролем (4-я группа), ^ - между концентрациями, p<0,05.Таблица 11. Влияние верапамила на морфофункциональные показателиперитонеальных макрофагов (M±m)ПоказателиКонтрольВерапамил (конц.)0,00005 мл-10,0001 мл-1МТМ, %60,5±3,148,1±1,7*36,2±2,6*^TNF-, пг/мл321,3±21,1164,2±14,7*97,4±6,8*^IL-1, пг/мл54,4±4,240,1±1,7*27,1±2,6*^Примечание: * - достоверность различий между 5-й группой (верапамил),и контролем (4-я группа), ^ - между концентрациями, p<0,05.Выявление наличия фармакологического эффекта уконцентрациях 0,00005 мл-1 и 0,0001 мл-1 в отношениидилтиазема вперитонеальныхфибробластов и макрофагов, оценка его выраженности по сравнению сверапамиломпоказали,чтодилтиазем,хотяиснижаетчрезмернуюфункциональную активность данных клеток соединительной ткани, но его111нормализующее действие менее выражено, чем у верапамила (табл.

11, 12, рис.10, 11).Таблица 12. Влияние дилтиазема на морфофункциональные показателиперитонеальных фибробластов (M±m)ПоказателиКонтрольМИДилтиазем (конц.)0,00005 мл-10,0001 мл-111,7±0,49,4±0,3*^27,2±0,9*17,5±0,5*^26,7±1,718,9±1,2*14,3±1,1*^1,6±0,121,5±0,11,28±0,06*12,3±0,4фибробластов, %КоличествоKi- 32,6±0,7*67+ клеток, %Оксипролин,мкмоль/лГиалуроноваякислота, ммоль/лПримечание: * - достоверность различий между 6-й группой (дилтиазем), иконтролем (4-я группа), ^ - между концентрациями, p<0,05.Прослеживалась зависимость эффекта от концентрации препарата.Добавление к культуральной среде дилтиазема в дозе 0,0001 мл-1 приводило кстатистически значимому в сравнении с контролем снижению уровней митозовфибробластов, количества Ki-67+ клеток, макрофагальной трансформациимоноцитов, коллагена и гиалуроновой кислоты (табл.

12), TNF- и IL-1 (табл. 13,р<0,05).112МИОПКГМТМTNF-αIL-10%-10%-20%-30%*****-40%**-50%0,5 мг/мл1,0 мг/мл*-60%-70%-80%Рисунок 11. Влияние дилтиазема на морфофункциональные показателиперитонеальных фибробластов и макрофагов (процент снижения от уровняконтроля). * - p<0,05При меньшей концентрации дилтиазема (0,00005 мл-1) достоверныхразличий с контролем у 4 из 7 исследованных показателей не найдено (табл.12,13).Таблица 13. Влияние дилтиазема на морфофункциональные показателиперитонеальных макрофагов (M±m)ПоказателиКонтрольДилтиазем (конц.)0,00005 мл-10,0001 мл-1МТМ, %60,5±3,156,5±4,347,3±2,9*TNF-, пг/мл321,3±21,1253,1±9,3*198,1±10,1*^IL-1, пг/мл54,4±4,247,2±2,139,8±2,3*^Примечание: * - достоверность различий между 6-й группой (дилтиазем), иконтролем (4-я группа), ^ - между концентрациями, p<0,05.113Нифедипин в концентрациях 0,00005 мл-1 и 0,0001 мл-1 не оказывалдействия на культуру активированных фибробластов и макрофагов, не влиял наколичество оксипролина и гиалуроновой кислоты (табл.