Диссертация (Блокаторы медленных кальциевых каналов новые возможности использования в качестве регуляторов образования соединительной ткани), страница 17

Корреляционная связь интенсивности процесса спайкообразования иметаболизма соединительной ткани при моделированиигемоперитонеума у кроликовКоличество спаек Оксипролин,Гиалуроноваямкмоль/лкислота, ммоль/л1,000,950,93Оксипролин, мкмоль/л 0,951,000,86Гиалуроновая кислота, 0,930,861,00Количество спаекммоль/лНаряду с коллагеном важную роль в регенераторных, дистрофических ивоспалительных процессах играют гликозаминогликаны.Как известно, дляколлагеногенеза необходимо создание матрикса, состоящего не только изволокнистых структур, но и из аморфного вещества, основным компонентомкоторого являются гликозаминогликаны, синтезируемые фибробластами измоносахаридов.последовательноВпроцессесинтезируютрепаративнойрегенерациинесульфатированныефибробластгликозаминогликаны(гиалуроновую кислоту), затем сульфатированные гликозаминогликаныпоследнююочередьтропоколлаген,-которыйприпомощии вкислыхгликозаминогликанов формируется в волокна коллагена [276].

В соединительнойткани доминирующее значение имеют кислые гликозаминогликаны, к которымотноситсягиалуроноваякислота.Проведенныйнамисравнительныйколичественный анализ гиалуроновой кислоты, секретируемой активированнымиперитонеальными фибробластами in vivo, выявил статистически значимоеувеличение ее содержания в перитонеальной жидкости кроликов на 10 суткипослемоделированиятроекратно превышалгемоперитонеума.Уровеньгиалуроновойкислотыаналогичный у интактных животных (табл.5, рис.7).99Проведенный корреляционный анализ между числом спаек и количествомгиалуроновой кислоты в брюшной полости показал наличие сильной прямойсвязи между исследованными параметрами (табл. 6, r=0,93, p<0,05).

Более того,изменение синтеза активированными фибробластами коллагена и гиалуроновойкислотыбылооднонаправленным.Увеличениеколичествапоказателей,характеризующих волокнистые структуры и аморфное вещество соединительнойткани, было взаимосвязано. Между количеством оксипролина и гиалуроновойкислоты в перитонеальной жидкости при усиленном спайкообразовании врезультате моделирования гемоперитонеума также была выявлена сильная прямаясвязь (табл. 6, r=0,86, p<0,05).Таким образом, чрезмерному росту соединительной ткани способствуетинтенсификация выработки фибробластами коллагена и гликозаминогликанов,что подтверждается увеличением содержания белковосвязанного оксипролина игиалуроновой кислоты в перитонеальной жидкости экспериментальных животныхс асептическим воспалением брюшины, выявлением зависимости между уровнемспаечногопроцессаисинтезомфибробластамиосновныхкомпонентовмежклеточного матрикса соединительной ткани.3.2.2.

Содержание провоспалительных цитокиновв перитональной жидкости крыс на этапах пролиферациии завершения воспалительного процесса при гемоперитонеумеЧрезмернаяактивацияспайкообразования приперитонеальныхфибробластовнаэтапахгемоперитонеуме сопровождалась моделированиемфункциональной активности их микроокружения, прежде всего – макрофагов,основных продуцентов провоспалительных цитокинов.

Именно они приводят ксинтезу новых коллагеновых структур и заживлению дефекта путем цитокиновойрегуляциифункциональнойактивностифибробластов. Провоспалительныецитокины TNF- и IL-1 являются индукторами хемотаксиса фибробластов, ихпролиферации, продукции коллагеназы и синтеза коллагена, других компонентов100матрикса. Эти цитокины принято считать главной причиной негативныхпоследствийвоспалительногопроцесса,например–усиленногоспайкообразования [118, 225, 226].Сравнительный анализ содержания провоспалительных цитокинов вперитонеальномэкссудатекрысна10суткипослемоделированияаутогемоперитонеума и контрольных животных выявил статистически значимоеувеличение содержания TNF- и IL-1 у экспериментальных крыс 2-й группы(серия I).

Наиболее выраженные отклонения от нормы регистрировались приопределении уровня TNF-, содержание которого в перитонеальной жидкостиконтрольных крыс не превышало минимальной определяемой концентрации(1пг/мл). У крыс, перенесших гемоперитонеум, на 10 сутки после введения вбрюшную полость аутокрови количество TNF- превышало контрольныезначения в 25 раз (табл.

7, рис.8).Таблица 7. Содержание провоспалительных цитокинов в перитониальнойжидкости крыс с гемоперитонеумом (М±m)ПоказателиГруппы животных2-я (гемоперитонеум)3-я (контроль)TNF-, пг/мл251,1 ± 7,3*10,3± 0,4IL -1, пг/мл12,7 ± 0,8*3,7 ± 0,3Примечание:* – достоверность различий показателейв группе интактныхживотных и животных с гемоперитонеумом, р<0,01.Определение количества IL-1 в перитонеальной жидкости крыс сгемоперитонеумом выявило, что уровень данного провоспалительного цитокинабыл повышен. Усиление синтеза IL-1 хотя и было менее выражено, чем TNF-,достигало 3-х кратного увеличения (табл. 7, рис 8).

При этом контрольныезначения IL-1, также как TNF-, не превышали минимальной определяемойконцентрации. Связь изменений содержания цитокинов с выраженностью101**300%Контроль200%Активированные клетки100%0%TNF-αРисунок8.IL-1Увеличениеколичествапровоспалительныхцитокиноввперитониальной жидкости крыс с гемоперитонеумом (процент от уровняконтроля), * - р <0,05.спайкообразования у экспериментальных животных 2-й группы подтвержденарезультатами корреляционного анализа. Прямая корреляционная зависимостьобнаружена между содержанием TNF- и числом спаек, IL-1 и числом спаек скоэффициентами корреляции 0,55 (р<0,05) иПроведенныеисcледования0,87 (р<0,01) соответственно.свидетельствуюточрезмернойпродукцииперитональными мононуклеарами провоспалительных цитокинов на этапахпролиферации и завершения воспалительного процесса в брюшной полости крыс,иучастииданныхпатофизиологическихмеханизмоввизбыточномспайкообразовании.РезюмеВ ходе проведенного фрагмента исследования было доказано, чтопредложеннаяэкспериментальнаямодельасептическогоперитонеальногоспайкообразования (аутогемоперитонеум) является универсальной и адекватнойдляизучениямеханизмовформированияиметодовпрофилактикивнутрибрюшинных спаек, поскольку получены равнозначные морфологические и102функциональные эквиваленты формирования спаечного процесса в брюшнойполости разных видов лабораторных животных.

Наличие спаечного процессабыло подтверждено макро- и микроскопически на 7-10 сутки с момента введенияаутокровивбрюшнуюполостьрегистрациеймножественныхсоединительнотканных спаек, количество которых было сопоставимовэкспериментальных группах крыс и кроликов. Спаечный процесс сопровождалсяувеличениемактивности перитонеальных фибробластов имакрофагов сусилением темпов синтеза компонентов межклеточного матрикса и продукциипровоспалительных цитокинов.

Количество оксипролина, одного из основныхбиохимических маркеров интенсивности образования соединительной ткани, игиалуроновойкислотывперитонеальнойжидкостиживотныхсгемоперитонеумом было увеличено в 7 и 3 раза соответственно. Выявленизбыточный синтез макрофагами провоспалительных цитокинов TNF- и IL-1,уровень которых в перитонеальной жидкости крыс с гемоперитонеумомпревышал контрольные значения в 25 и 3 раза соответственно.

Усиленнаяактивность фибробластов и макрофагов и уровень спаечного процесса пригемоперитонеуме были взаимосвязаны. Связь изменений коллагенсинтетическойактивности перитонеальных фибробластов, содержания гиалуроновой кислоты ицитокинов с выраженностью спайкообразования подтверждена результатамикорреляционного анализа.Созданиеадекватнойэкспериментальноймоделиспайкообразования,комплексный подход в исследовании избыточного разрастания соединительнойткани с выявлением патогенетических факторов формирования спаек даетвозможностьвоспроизведенияи достоверной оценкиспаечногопроцесса,являются основой для его фармакологической регуляции с использованиемлекарственных средств, обладающих общим воздействием на патогенетическиезвенья спаечного процесса и прежде всего на фибробласты, возможныминструментом влияния на функции которых могут быть блокаторы медленныхкальциевых каналов.103ГЛАВА 4ОЦЕНКА ДОЗОЗАВИСИМОГО ЭФФЕКТА РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ И МАКРОФАГОВБЛОКАТОРАМИ МЕДЛЕННЫХ КАЛЬЦИЕВЫХ КАНАЛОВ ПРИИСПОЛЬЗОВАНИИ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ4.1.

Морфо-функциональная характеристика перитонеальныхфибробластов и макрофагов в культуре клетокПроведенные исследования с использованием культур клеток (серия II)показали, что через 24 ч экспозиции в питательной среде во всех исследуемыхгруппах (с 4-й по 8-ю) монослой клеток был целостным и равномерным.Фибробласты в культуре образовали систему из параллельно расположенныхклеток веретенообразной формы. Преобладали активированные фибробластыимеющие большую величину и отростки, неактивные фибробластыразмероввстречалисьреже.Макрофагивыгляделикакменьшихраспластанныеудлиненные клетки с большим количеством отростков, моноциты сохранялиобычную форму иразмеры.Данные исследования морфологических ифункциональных характеристик перитонеальных фибробластов и макрофагов вкультуре клеток представлены в табл.8.Анализих состояния показал, что в культуре клеток, полученной отинтактных крыс (8-я группа), пролиферативная активность фибробластов через24 часа культивирования была низкой.

У фибробластов, полученных от животных4-й группы, через 10 суток после моделирования гемоперитонеума, активность104Таблица8.Морфофункциональныепоказателиперитонеальныхфибробластов (M±m)ПоказателиГруппы4-я (активированные 8-я (неактивированныеклетки)клетки)МИ фибробластов, %12,3±0,4*2,3±0,2Количество Ki-67+ клеток, %32,6±0,7*3,7±0,3Оксипролин, мкмоль/л26,7±1,7*6,5±0,4Гиалуроноваякислота, 1,6±0,12*0,5±0,03ммоль/лПримечание: * - достоверность различий между группами, p<0,05.митотического процесса в культуре клеток была высокой, она в 5,3 раза (p<0,05)превышала показатели8-й группы (рис.9).

Выявлено наличие тесной иположительной связис коэффициентом корреляции 0,91 (p<0,05) междупоказателем пролиферации фибробластов и числом соединительнотканных спаеквбрюшнойполостикрысна10-есуткипослемоделированияаутогемоперитонеума.Экспрессия маркера пролиферации, напрямую связанного с делениемклетки, белка Ki-67 в ядрах фибробластов интактных животных 8 группы непревышала 4%.У животных 4 группы, на 10 сутки после развитиягемоперитонеума, антиген Ki-67 маркировал 32,6% клеток, что было почти в 8 развыше контрольных показателей (табл.8).Оценкаосновнойколлагенсинтетическойфункциифибробластов,заключающаяся в определении в культуральной среде белковосвязанногооксипролина-маркераколлагена,показала,чтопримоделированиигемоперитонеума, сопровождающегося повышенным спайкообразованием вбрюшной полости крыс в культуре активированных in vivo фибробластов105МИ600%500%*400%300%IL-1200%**100%ОксипролинКонтроль0%Группа 4*МТМРисунок9.*К-тагиалуроноваяМорфофункциональныепоказателиактивированныхперитонеальных фибробластов и макрофагов 4-ой группы ( процент отклоненияот уровня неактивированных клеток 8-й группы).

* - р<0,05.наблюдалось стимулирование образования белковосвязанного оксипролина,который является характерным компонентом фиброзной соединительной ткани.Установленоповышениеколлагенсинтетическойфункцииактивированныхфибробластов (4-я группа) в 4,2 раза по сравнению с неактивированнымиклетками (8-я группа, p<0,05, рис.9). Отмечена прямая корреляционная связьмежду количеством белковосвязанного оксипролина и числом спаек в брюшнойполости крыс с аутогемоперитонеумом (r=0,78, р<0,05).Сравнительный анализ секретируемой фибробластами гиалуроновойкислоты, являющейся, наряду с коллагеном, одним из основных компонентовмежклеточного матрикса соединительной ткани, выявил статистически значимоеувеличение ее содержания в культурах активированных клеток (4-я группа).Сопоставление уровней гиалуроновой кислоты в супернатантах культурфибробластов в 4-й и 8-й групп продемонстрировало 3-кратное увеличение106синтеза гиалуроновой кислоты активированными in vivo перитонеальнымифибробластами, в результате моделирования у крыс гемоперитонеума (табл.8,рис.9 р<0,05).Исследованиеклетокмикроокружения(моноцитовимакрофагов)перитонеальных фибробластов выявило, что моноциты, полученные от крыс на 10сутки гемоперитонеума (4-я группа), демонстрировали в культуре высокуюспособность к трансформации в макрофаги (табл.9, рис 9.).