Диссертация (Блокаторы медленных кальциевых каналов новые возможности использования в качестве регуляторов образования соединительной ткани), страница 15

Электрофизиологические методыИзучение в отдельной серии острых опытов дозозависимого влиянияверапамила на уровни систолического, диастолического и среднего артериальногодавления, периферическое сосудистое сопротивление и показатели сердечноговыброса проводили на полифизиографе МАИТ – 01 «Данко» производства ООО«Медицинские системы», город Ростов-на-Дону с электроманометрическим,электрокардиографическим и реографическим блоками. Измерение артериальногодавления производили прямым методом путем катетеризации левой общей83сонной артерии.

Электрокардиографические показатели регистрировались встандартных отведениях с помощью игольчатых электродов, вводимых под кожуконечностей. О функциях автоматизма и проводимости миокарада судили,оценивая ритм, частоту импульсации, длительность интервалов, амплитуду иконфигурацию зубцов, ширину и конфигурацию комплекса QRS и сегмента ST.Большинство показателей системной гемодинамики расчитывалось по даннойинтегральной реографии и ее первой производной. Интегральную реограммурегистрировали последовательно с ЭКГраммой с игольчатых электродов,введенных под кожу передних конечностей. Расчет величины ударного объемасердца (УО, мл), минутного объема кровообращения (МОК, мл), общегопериферического сопротивления сосудов (ОПС, дин  с  см –5)производилипо стандартным формулам.2.4.

Фармацевтические исследования2.4.1. Разработка верапамилсодержащего кремаВ качестве модельной лекарственной формы для местного примененияпациентамсгипертрофическими/келлоиднымирубцамибылразработанантирубцовый крем (патент 2290919 РФ).

Основным действующим веществом воригинальном креме являетсяфармакологическимэффектомБМКК верапамил, обладающий выраженнымвотношенииизбыточнойпродукциизаместительной соединительной ткани. Верапамил введен в состав жировойосновы, которая полностью "копирует" состав кожного жира по водно-жировомубалансу и играет решающую роль в биодоступности лекарства, служа активнымпроводником препарата через кожу в ткань рубца. В качестве консервирующего,противовоспалительного, антимикробного и противоотечного, а также дляповышения проникающей способности крема в состав введен димексид.Антирубцовый крем содержит 0,25% раствор верапамила гидрохлорида,ланолин, вазелин, димексид в следующем соотношении компонентов (табл.

3).84Таблица 3. Состав антирубцового крема№1.2.3.4.Компонентыраствор верапамиладимексидвазелинланолинМассовая доля25 - 35%4 - 6%11 - 19%40 - 60%Процентное соотношение указанных компонентов обосновано теоретически иподтверждено стендовыми испытаниями.2.4.2. Фармакотехнологические методы2.4.2.1. Метод получения модели биологической мембраныМетодомжидкостнойпробоподготовкихроматографиидля(ВЭЖХ)припроведениявысокоэффективнойисследованиибиологическойдоступности и высвобождения верапамила из лекарственной формы был выбрандиализ через полупроницаемые мембраны, которые были получены путемприготовления 6% раствора лецитина в кипящем 95 мас.% спирте этиловом,погружения мелкопористых бумажных фильтров "синяя лента" диаметром 5-20см в раствор лецитина и выдерживания в нем, удаления избытка спирта отфильтров доаэрацией.

Созданные мембраны имели большуюрабочуюповерхность и были близки к натуральным биологическим мембранам.2.4.2.2.Метод диализа через полупроницаемую мембрануНа образец модели биологической мембраны наносили слой разработанногоантирубцового крема толщиной 1,0 – 1,5 мм площадью 25 см2 (5см*5см), общеймассой 0,1 г. Полученную конструкцию закрепляли в держателе и погружали вхимический стакан с 50,0 мл воды очищенной. Перемешивание вели на85магнитной мешалке при скорости перемешивания приемного раствора 80 ± 1 об /мин.

В ходе эксперимента систему термостатировали при температуре 37º ± 1 ºС.Через заданные промежутки времени из стакана отбирали пробы в количестве 1мл, восполняя объем водой очищенной. В отобранной пробе определялисодержание верапамила методом ВЭЖХ.2.4.2.3. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографииКоличественное описание зависимостей удерживания ЖРВ от содержанияорганического компонента в подвижной фазе проведено по уравнениюуниверсальной квазихимической модели удерживания в ВЭЖХ, учитывающеймежмолекулярные взаимодействия (образование ассоцнатов и комплексов)компонентовхроматографическойсистемы.Дляопределенияколичестваверапамила гидрохлорида использовали метод обращенно-фазовой ВЭЖХвысокого давления.Разделения выполнены на жидкостном хроматографе "Shimadzu LC-20 Prominence " со спектрофотометрическим детектором (Я=254 нм)в изократическом режиме в следующих условиях:- аналитическая колонка, заполненная сорбентом PerfectSil 300 ODS C18, 4,6 х250 мм, с размером частиц 5 мкм;- состав подвижной фазы: ацетонитрил – 0,1 % водный раствор кислотыфосфорной в соотношении 50:50;- детектирование при длине волны 254 нм;- температура колонки - комнатная;- скорость подвижной фазы 0,5 мл/мин;- объем вводимой пробы 20 мкл.Расчет данных производили с использованием программного обеспеченияLC Solutions.862.4.3.

Способ приготовления антирубцового кремаСпособ приготовления крема заключается в следующем: расплавляютжировое сырье: ланолин, вазелин. Затем фильтруют и смешивают с верапамилом.Эмульсию, постоянно перемешивая (10-15 мин) в котле с пропеллерноймешалкой, нагревают до 60°. Готовую эмульсию насосом перекачивают в котелхолодильник, охлаждают до 40° и обрабатывают на кавитационной мельнице сводяным охлаждением.

После мельницы масса поступает в холодильник, где при40° в основу крема вводят димексид. Охлаждают до 30 градусов и берут пробу наанализ. Крем должен быть однородным, без посторонних примесей, белого цветас содержанием влаги 30-40%.2.5. Характеристика материала при моделированиипатологических рубцов кожиЭкспериментальныеисследованияпроведенына106белыхбеспородных крыс-самцах массой 220 - 240 г., которым по [147] моделировалипатологические кожные рубцы, морфологически и патофизиологическиблизкие к патологическим рубцам человека (гипертрофическим и келоиднымрубцам). Воспроизведение патологического рубца проведено путем иссеченияполнослойного лоскута кожи площадью 5х4 см2в центре спины ипоследующего заживления раны.

После формирования рубца (на 55 сутки сначала эксперимента) проводили лечение с использованием оригинальногоантирубцового крема с верапамилом. Для исследования эффективностиантирубцового крема на основе верапамила, согласно листу рандомизациибыли сформированы две экспериментальные группы: 1-ая – основная (n=36),получавшая верапамил в составе антирубцового крема, исравнения (n=36) с нанесением2-ая - группаводно-вазелин-ланолиновой основы с87димексидом без верапамила.

Контрольные группы составили 12 интактныхкрыс (контроль 1) и 15 крыс, без травматического воздействия, которымантирубцовый крем наносился на здоровый участок кожи в центре спины ваналогичных с основной группой режимах воздействия лекарственногосредства и сроках забора материала для исследований (контроль 2).Проводилось ежедневное 2-кратное втирание используемого крема или егоосновывзонуформирующегосярубца.Контрольэффективностипрофилактики проводили через 10, 30 и 60 суток с момента заживления раны.2.5.1. Характеристика рубцовых повреждений кожиДля характеристики рубцовых повреждений кожи и оценки клиническойэффективности антирубцового крема с верапамилом была применена следующаяшкала, в соответствии с которой фиксировались изменения состояния рубцов вбаллах:размеры рубца (площадь в см2): менее 1 см2 -1 балл,1-5 см2 – 2 балла,5-10 см2– 3 балла,10-15 см2 – 4 балла, более15 см2 -5 баллов;тип рубца: физиологический - 0, гипертрофический гомогенный -1,гипертрофический с мелкими узелками-2, гипертрофический с грубымиузлами - 3, заметный келоид- 4, выраженный келоид- 5;цвет рубца: окраска здоровой кожи - 0, легкая эритема - 1, выраженнаяэритема - 2; консистенция рубца: нормальная - 0, легкое уплотнение - 1 ,выраженная индурация - 2;чувствительность рубца: отсутствие боли - 0, боль - 4;данные сравнительной биомикроскопии: более 20 единиц- 0,15; 20 единиц 1, 10-15 единиц - 2,5, 10 единиц - 3, до 5 единиц- 4.Сумма показателей шкалы до 5 баллов, расценивалась как хорошийрезультат, от 5 до 10 баллов - как удовлетворительный, а более 10 баллов - какнеудовлетворительный.882.5.2.

Биомикроскопия кожиСравнительную биомикроскопию с оценкой состояния микроциркуляции взоне послеожоговых гипертрофических/келлоидных рубцов производили спомощью устройства для биомикроскопии кожи, принцип работы которогозаключается в биомикроскопии кожи в области рубца экспериментальных крыс исимметричных ему точек тела контрольных животных в отраженном свете сфокусированиемсигналоввполученногоэлектрическиеизображения[281].наУстройствопреобразователедлясветовыхопределенияиндексакапиллярной асимметрии изготовлено на базе тубуса с объективом, окуляра иисточника света капилляроскопа М-70А. Преобразователь световых сигналовразмещен перед окуляром.

Световой поток от источника света направляется наисследуемый объект. Отражаясь от него, луч проходит через объектив, окуляр изатем попадает в преобразователь световыхСравниваютсясигналов в электрические.показатели, полученные с участков кожи, покрытых рубцовойтканью и с симметричных участков здоровой кожи. Расчет индекса капиллярнойасимметрии производится в относительных единицах по формуле:С)х100, где К -К = (В :индекс капиллярной асимметрии, В – показатели всимметричных точках тела, С – показатели в области рубца.2.6. Методы статистического анализа полученных результатовРазмер выборки каждой группы и подгрупп для получения достоверныхрезультатов проводимых экспериментальных и ретроспективных клиническихисследований определяли по формуле (Lopez-Jimenez F. et al., 1998).N = [p 1*(100 - p)] + [p 2 * (100 – p 2)] * 7,9(p 1 – p 2)289где N - число экспериментальных животных или пациентов, которое требуетсядля получения достоверных результатов; p1 – ожидаемое значение первичнойпеременной интереса для одной из групп (или подгрупп) сравнения в процентах;p2 - ожидаемое значение первичной переменной интереса для другой группы (илиподгруппы)сравнениявпроцентах.Согласнопроведеннымрасчетам,необходимое минимальное количество составило 9 - 12 исследуемых в группах.Для увеличения достоверности статистического анализа количество наблюденийв группах было доведено до 20 и более.