Диссертация (Получение и стандартизация эритроцитарных носителей, инкапсулированных терпено-индольными алкалоидными противоопухолевыми препаратами), страница 6

Этот метод называется амперометрия. В общем, чемниже потенциал окисления или восстановления аналита, тем лучше предел обнаружения и селективность. ЭХ детектирование чаще всего используется при анализе катехоламинов и ароматических аминов, так как эти соединения легкоокисляются при низких потенциалах. Однако большинство алкалоидов также содержат окисляемые функциональные группы и хорошо подходят для обнаружения окислительного ЭХ потенциала. Многие из них содержат либо фенольнуюгруппу, либо индольные ядра, и еще больше содержат третичный алифатическийамин. Кроме того, многие алифатические спирты и амины, которые окисляютсяпри высоких потенциалах на углеродных электродах, могут быть обнаруженыпри гораздо меньших потенциалах с помощью золотых или платиновых электродов. Алкалоиды, однако, обычно не содержат легко приводимых групп, такихкак хиноны или ароматические нитрогруппы.При ЭХ детектировании подвижная фаза должна проводить ток.

Большинство подвижных фаз, используемых в обращенно-фазовой и ионообменной хроматографии, способны выполнять это требование, поскольку они состоят из водного буфера и одного или более полярных органических растворителей, такихкак метанол или ацетонитрил. Такие элюенты также использовались с немодифицированными колонками диоксида кремния в меньшей степени.

Проводимость обычно достаточна, когда ионная сила буфера находится между 0,01-0,1М.31Naaranlahti T. et al .[84] разработали ВЭЖХ метод с электрохимическимдетектированием для исследования C. roseus алкалоидов. Разработаны методикис применением колонки Supelcosil LC-18-DB (150 х 4,6 мм, диаметр 5 мкм). Изократическое разделение аджмалцина и катарантина достигалось при скоростипотока 1,0 мл/мин, используя 0,1 М ацетат натрия - метанол - ацетонитрил(49:15:36, pH 6,5) в качестве подвижной фазы.

В качестве эталонного электрода вячейке служил твердый Pd-Pd-черный электрод. Naaranlahti T. et al. сообщают,что потенциалы, которые применяли в данной работе, на 0,24 - 0,3 В ниже, чемпри использовании электрода сравнения Ag-AgCl. Авторы в проведенном эксперименте установили содержание исследуемых алкалоидов аджмалцина и катарантина (0,465 мкг/мл и 0,467 мкг/мл).1.2.4.2.

Методы радиоиммунологического анализа алкалоидов C. roseusЛитературные данных показывают, что радиоиммуноанализы (РИА), в основном, разработаны для определения ингибиторов новообразований VCR иVLB в крови. Разработка радиоиммуноанализов VCR и VLB привела к более подробным информациям о распределении и элиминации этих препаратов в организме.

Методом радиоиммунологического анализа можно обнаружить до нг/млсодержания в исследуемых образцах с высокой достоверностью [139; 212; 236].1.2.4.2.1. Методы обнаружения ТИА в живых клеткахФлуоресцентные винбластин-флуорофором конъюгаты для получения изображений о содержании ТИА в живых клеткахЛаброс Мейметис (Labros G. Meimetis) и коллеги разработали новые методики для обнаружения VLB в живых клетках на основе применения флуоресцентных винбластин-флуорофором конъюгатов [97].

Их метод был основан наполучении ацилазид соединения из VLB, которые в дальнейшем реагируют сэтилендиамином, либо 1,11-диамино-3,6,9-триоксаундеканом для получения соответствующих аминов. Затем с соответствующими флуресценцирующими соединениями (бора-дипиррометена флуорофор – BODIPY и кремний-родамин SiR) получили VLB-флуорофором конъюгаты.32Ацилазид получили путем обработки VLB гидразином в метаноле при 60 °С для получения дезацетилвинбластинового гидразида (рис 1.3).а.б.Рис.

1.3. а. Синтез винбластин-флуорофор конъюгатов. б. Спектры возбужденияи излучения винбластин-конъюгатов в фосфатно-солевом буфере (PBS).NHS - Карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловый эфир (Carboxyfluorescein succinimidyl ester)Гидразид затем растворяли в 1,0 М HCl при 0 °С и перемешивали с нитритом натрия в течение 10 минут, образуя соответствующий ацилазид. Это промежуточное соединение сразу же подвергали взаимодействию либо с этилендиамином, либо с 1,11-диамино-3,6,9-триоксаундеканом с получением аминов соответственно.

Соответствующие флуорофоры для визуализации живых клеток33должны быть яркими, фотостабильными и нетоксичными. Они выбрали флуорофор на основе зеленого излучающего бора-дипиррометена (BODIPY) и дальнийкрасный излучающий кремний-родамин (SiR) для конъюгации.Для получения спектров флуоресценции поглощения и излучения конъюгатов 2a / 2b, 3a / 3b и 4a / 4b, 10 мМ исходного раствора ДМСО разбавляли до1,0 мкм с использованием PBS и затем сканировали. Измерения квантового выхода были получены путем разбавления 10 мМ ДМСО запасами зондов 2a / 2b и3a / 3b до 0,5-2,5 мкм в этаноле и 10 мМ исходного раствора ДМСО 4a / 4b до0,5-2,5 мкм в этаноле / 1,0 мМ HCl.

Спектры зарегистрированы на длине волнывозбуждения при 470 нм для конъюгатов 2a / 2b, 3a / 3b и коммерческий VLBBODIPY (ThermoFisher Scientific, США) и при длине волны возбуждения 640 нмдля конъюгатов 4a / 4b.Лаброс Мейметис и коллеги применением синтезированными конъюгатами VLB-флуорофоров получили высококачественные изображения в живыхклетках. Они предполагают, что эти зонды найдут применение в исследованииодноклеточной фармакокинетики, фармакодинамики и механизмов транспортировки ЛС в тканях и клетках.1.3.

Фармакологические свойства VCR и VLBC. roseus долгое время использовался в традиционной медицине тропических и субтропических стран для лечения диабета, гипертонии, кровотечения,цинги, зубной боли, лихорадки денге, дизентерии, укусов насекомых, инфекцийкожи, диареи, лейкемии, раздражении глаз, диспепсии, дизентерии, боли в горле,закупорки легких и др. [180; 218; 243; 261]. Листья и корни C. roseus в традиционной и аюрведической медицине в Шри Ланке применяются для лечения сахарного диабета, дизентерии, зубной боли, ревматизма, запора.

Интересы западных исследователей привели к C. roseus при исследованиях чая из C. roseus в1949 г., который применял Джамейсканский народ для лечения сахарного диабета [225]. В настоящее время in vivo и in vitro исследованиями доказано гипогликемическое [29; 180; 218], гипотензивное [34; 111], антибактериальное [27; 40;34103; 125], противомалярийное, антиаритмическое и др.

свойства C. roseus [27;180; 218]. Димерный ТИА - VCR является широко применяемым противоопухолевым агентом с 1960 г. [46; 175; 187; 265]. VCR используется в качестве противоопухолевого препарата как в моно-, так и в комбинированном режиме химиотерапии [35; 81; 155; 188; 261] . VCR впервые был успешно использован у взрослых и детей в качестве цитотоксического агента в 1962 году и остается одним изнаиболее широко применяемых противоопухолевых агентов в некоторых схемаххимиотерапии.VCR применяется при остром лимфобластном лейкозе [32; 124; 211; 260;261], лимфоме Ходжкина [222; 261] и неходжкиской лимфоме[51; 124; 175; 188],саркоме мягких тканей [95], опухолях головного мозга [261], лимфогранулематозе, лимфосаркоме, миеломной болезни, саркоме Юинга [261], остеогенной саркоме, фунгоидной гранулеме, рабдомиосаркоме [261] (в т.ч.

эмбриональная), раке молочной железы [124], раке легкого [222] (мелкоклеточный) [68; 124], меланоме, грибовидном микозе, саркоме Капоши [68; 134; 248; 261], раке почечнойлоханки и мочеточников, раке мочевого пузыря [68], опухоли Вильмса, нейробластоме, раке шейки матки, саркоме матки, герминогенной опухоли яичка ияичников, хорионэпителиоме матки, эпендимиоме, менингиоме, плеврите опухолевой этиологии, злокачественных опухолях половых органов у девочек,идиопатической тромбоцитопенической пурпуре [261].VLB применяют при лимфогранулематозе, неходжкинской лимфоме [94;225], грибовидном микозе, герминогенной опухоли тестикул, герминогеннойопухоли яичника [94], хорионэпителиоме, миеломной болезни, саркоме Капоши[250], болезни Леттерера-Сива [4], нейробластоме, раке почки [5], раке мочевогопузыря [182], рак легкого, опухоли головы и шеи.

Незначительные структурныеразличия между VCR и VLB приводят к различиям в их противоопухолевыхспектрах, терапевтическом потенциале и токсичности [214].351.3.1. Современное положение VCR и VLB в химиотерапииОнкологические заболевания, остаются одними из самых опасных. Согласно данным ВОЗ наблюдается 10 миллионов новых случаев каждый год. Темне менее, за последнее время смертность уменьшилась, благодаря лучшему пониманию биологии опухоли и улучшенным диагностическим приборам, раннейдиагностике, а также процедурам лечения. Противоопухолевая химиотерапия –один из важнейших и наиболее динамично развивающихся отделов современнойонкологии. Химиотерапия злокачественных опухолей – это использование с лечебной целью лекарственных средств, тормозящих пролиферацию или необратимое повреждение опухолевых клеток. В настоящее время противоопухолеваяхимиотерапия применяет различные режимы и различные группы противоопухолевых препаратов (антиметаболиты, цитостатики, алкилирующие соединенияи др.).

При этом ТИА - VCR, VLB и их производные в качестве цитостатиковвключают в моно- и комбинированный режим [242] химиотерапии при леченияразличных онкологических заболеваний. Фундаментальная идея современнойонкологии, лежащая в основе применения комбинированных режимов противоопухолевой химиотерапии, заключается в том, что разные противоопухолевыехимиопрепараты реализуют своё противоопухолевое действие через различныеклеточные механизмы. Поэтому предполагается, что результат их комбинированного применения может быть в некоторой степени синергичен (то есть совместное применение повышает эффективность терапии и снижает вероятностьразвития резистентности, устойчивости опухоли). Например,VCR применяется врежимы BACOD, m-BACOD, CHOEP, CHOP , ProMACE/MOPP (при неходжкинский лмфозе) [100], BEACOPP (при лимфогранулематозе), CAV (при раке лёгкого,КарциномеМеркеля),CVAMP(прилимфогранулематозе,лейкозе),ChlVPP/EVA (при лимфогранулематозе), VAI (при саркоме Юнинге и мезенхимальной хондросаркоме) и др.