Диссертация (1155054), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Хроматограммы сначала разгоняют в этилацетате, затем после высушивания проводиться второй прогон в подвижной фазе этилацетат: абсолютный спирт (3:1). В этом методе VCR показывает значение Rf 0,54.Двухмерная технология ТСХ применяется для разделения более сложных смесейалкалоидов из C. roseus. Пятна на ТСХ могут быть обнаружены при помощиультрафиолетового излучения (254 нм), опрыскивания хроматографической пластинка реагентом Драгендорфа [52], подкисленным иодплатиновым реагентом(K2PtI6) с раствором 1% сульфата церия аммония в 85% фосфорной кислоте.Камал Абид и др.
[221] разработали валидированный ВЭТСХ метод дляодновременного определения VCR и VLB в экстракте листьев C. roseus. В разработанной методике подвижная фаза состояла из толуол-метанол-диэтиламина всоотношении 8,75:0,75:0,5 соответственно. На основе полученной хроматограммы построили калибровочную кривую зависимости площади пика от концентрации [221].261.2.4.1.2. Газо-жидкостная хроматографияИз научно-исследовательской литературы известно о том, что ГЖХ применяется для идентификации VCR и алкалоидов C.
roseus. В данном методе используют стеклянные колонки с покрытым гексаметилдисилазаном и упакованным, неподвижной жидкой фазой 3% OV-101 (1,0 мм х 3,2 мм) газового хроматографа Chrom Q (80-100 меш) при программировании температуры от 200 до300 0С в течение 5 мин. Газ-носитель: азот при расходе 30 мл/мин и в качестведетектора изпользовали пламенно-ионизационный.1.2.4.1.3. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)ВЭЖХ является ценным инструментом в анализе растений благодаря своей высокой разрешающей способности и совместимости для определения нелетучих и термически лабильных соединений. Поэтому ВЭЖХ часто применялипри определении алкалоидов.
Для количественного определения препаратовгруппы ТИА в настоящее время наиболее часто используется метод ВЭЖХ. Этотметод рекомендован для обнаружения и количественного определения VLB иVCR в зарубежных фармакопеях (E.Ph.8.0; J.Ph XVII; B.Ph.2013; USP Convention2011). Несколько методов ВЭЖХ были использованы для определения VCR иего метаболитов в биологических жидкостях и тканях. Современные методыВЭЖХ в основном обеспечивают отделение и идентификацию амальцицина,серпентина, виндолина, VLB, VCR, лохнерицина, селологанина, стросозидина,капрантина, таберона, триптофана и триптамина (таблица 1.1).
Причина этогоограниченного списка алкалоидов Катарантуса основана на том факте, что никакие стандарты не являются коммерчески доступными пока для других алкалоидов, обнаруженных в C. roseus.При анализе сложных образцов с помощью ВЭЖХ важно выбрать системуобнаружения. Если хроматографическое разделение является неполным или аналитическая концентрация очень мала, то более универсальные и нечувствительные детекторы поглощения ультрафиолетового излучения (УФ) не являютсяудовлетворительными и должны использоваться другие системы обнаружения.27Обнаружение флуоресценции (FL) является чувствительной и селективной альтернативой для тех соединений, которые флуоресцируют.
Электрохимическое(EC) [84; 198] обнаружение отличается от УФ и FL тем, что оно основано на химической реакции, а не на физическом явлении и является лучшим выбором длямногих электроактивных соединений. Для обнаружения алкалоидов и прекурсоров C. roseus в настоящее время применяются различные современные детекторы, такие как матричная фотодиодная (Photodiode Array - PDA), флуоресценция,электрораспылительная ионизация- масс-спектрометрия (ESI-MS), тандемнаямасс-спектрометрия (MS-MS), ЯМР и круговой дихроизм (circular dichroism CD) [111].Несмотря на существующую обширную базу литературы по анализу индольных алкалоидов C.
roseus, продолжаются дальнейшие усовершенствованияметодов ВЭЖХ для лучшего разрешения и количественного определения важных алкалоидов - VCR, VLB, виндолина и катарантина. В научной литературепоказано, что для анализа этих алкалоидов применяются различные системырастворителей, буферы, длины волн обнаружения и колонки для разделения, такие как С8 и С18.
Некоторые исследователи утверждают, что в анализе на колонке С8 с использованием изократического элюирования с ацетонитрилом:карбонатом аммониия (43:57); виндолин первым элюируется из колонки, а последующим - VCR, катарантин и VLB. Данные представлены только для разделения стандартных образцов и было зарегистрировано низкое значение Rf длявсех четырех соединений. Аналогичную картину элюции сообщали другие исследователи, используя колонку С18 и градиентное элюирование метанолом: водой, содержащей 0,1% этаноламина с обнаружением при 238 нм. Большинствоисследователей использовали для обнаружения длины волн 254, 280 или 296 нм[49].
Кроме того Uniyal, G.C et al. [230] утверждают, что виндолин, VCR, VLB икатарантин обладают большей поглощающей способностью при 220 нм по сравнению с 254 или 280 нм [рис. 1.2 (A), (B) и (C) соответственно] и могут бытьопределены в диапазоне обнаружения 0,5-1,0 мкг или выше.28Рис. 1.2. ВЭЖХ хроматограмма [230]А- детектирование при 220 нм, B- 254 нм, С- 280 нм1.
VCR (Rt-14,62 мин), 2. Катарантин (Rt-15,92), 3. VLB (Rt-18,02 мин), 4. Ииндолин (19,60мин)Kumar et al. [117] применяли ВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометрией(HPLC/ESI-QTOF-MS/MS) для идентификации и распределения ТИА в этаноль29ных экстрактах C. roseus. В эксперименте хроматографическое разделение всехэкстрактов проводили на колонке Thermo Betasil C8 (250 мм × 4,5 мм, 5 мкм) при25 °С с использованием системы HPLC Agilent 1200. Подвижные фазы состоялииз 0,1% муравьиной кислоты / воды (A) и ацетонитрила (В) при скорости потока0,5 мкл/мин с использованием объема инжекции 1 мкл.
Градиентное элюирование составляло: 0-10 мин, 20-30% В (линейный); 10-20 мин, 30-30% В; 20-25мин, 30-80% В; 25-30 мин, 80-90% В, 30-37 мин, 90-20% В, наконец, подвижнаяфаза В поддерживалась на уровне 20% в течение последних 5 мин.Jimmy Black et al. применяли ВЭЖХ для исследования стабильности сульфата VLB в водном растворе [228]. В проведенном эксперименте они применялидля всех аналитических определений систему HPLC LC19533 с колонкой с обращенной фазой (p-Bondapak CIS, 10 мкм, 3,9 мм X 30,0 см, Waters P/ N 27324).Мобильная фаза состояла из 65% метанола и 35% водного раствора 0,01 М гидроксида калия, доведенного 8,9% раствором о-фосфорной кислоты до рН 4,5 идетектирование VLB проводили с помощью УФ-детектора при 254 нм.Won Tae Jeong et al.
[130] разработали новый метод масс-спектрометрии сультраэффективной жидкостной хроматографией (UPLC-Q-TOF), который обеспечивает чувствительное, быстрое и надежное обнаружение и идентификациюшести представительных индол-алкалоидов в C. roseus (VCR, VLB, аймалицин,капрантин, серпентин и виндолин). В эксперименте алкалоиды элюировали спомошью колонки С18 ацетонитрилом и водой, содержащей 0,1% муравьинуюкислоту и 10 мМ ацетат аммония, и отделили с хорошим разрешением в течение13 мин.
Для характеристики молекул и их фрагментных ионов проводился анализ ионизации электрораспылением Q-TOF (ESI-Q-TOF), а для идентификацииалкалоидов были использованы характерные ионы и фрагментация. Предлагаемый аналитический метод был проверен со ссылкой на руководящие принципыICH, и результаты показали отличную линейность (R2 > 0,9988), предел обнаружения (от 1 нг/мл до 10 нг/мл), предел количественной оценки (от 3 нг/мл до 30нг/мл), эффективности обнаружения (от 92,8 до 104,1%) для всех компонентов.301.2.4.1.4.
Анализ C. roseus алкалоидов методом ВЭЖХ с электрохимическимдетектированиемОпределение электрохимическим (ЭХ) детектированием основано на электрохимической поверхностной реакции. Когда на рабочий электрод проточнойячейки подается достаточный положительный или отрицательный потенциал,аналит либо окисляется, либо восстановливается на поверхности электрода. Результирующий ток, чаще всего сопровождаемый поддержанием постоянного потенциала, прямо пропорционального концентрации анализируемого вещества,проходящего через ячейку.