Диссертация (Адаптивное значение для человека бактерий рода Lactobacillus и рода Bifidobacterium), страница 11

Тотальное секвенирование ДНК штаммов было проведеноК.М. Климиной на платформе Roche 454.2.3.5 Выделение тотальной РНКРНК получали из культуры L.plantarum 90sk на различных стадиях роста:экспоненциальная фаза (5 часов), стационарная фаза (24 часа), поздняястационарная фаза (48 часов). 7 мл культуры откручивали в течение 5 мин. при4000 g, удаляли супернатант, осадок промывали раствором для стабилизацииРНК (RNA protect Bacterial Reagent, Qiagen, Нидерланды), снова откручивали10 минут при 5000 g и ресуспендировали в 1000 мкл тризола (Extract RNA,Евроген, Россия). Суспензию гомогенизировали в лизисных пробирках (innuSPEED Lysis Tube B) 3 раза по 20 сек на приборе Speed Mill Plus (Analytik JenaAG-Bio), затем охлаждали пробирки на льду.

Лизат центрифугировали при12000-15000 g в течение 10 минут для удаления нерастворённых фрагментов.59Отбирали супернатант и добавляли туда 0,2 мл хлороформа. Активноперемешивали встряхиванием, затем центрифугировали 15 минут при 4°С.Верхнюю водную фазу отбирали и добавляли туда 0,5 мл 100% изопропаноладля осаждения РНК.

Образец центрифугировали при 12000g в течение 10минут, затем удаляли супернатант. Добавляли 2 мл 75% этанола и откручивалиобразец на максимальной скорости. Полученный осадок РНК растворяли всвободной от РНКаз воде. Далее пробу обрабатывали ДНКазой (Rnase-FreeDNase, Qiagen, Нидерланды) в течении 30 минут и очищали пробу на колонкахнабором RNeasy MiniKit (Qiagen) в соответствии с инструкцией отпроизводителя. РНК хранили при -80°С.

Концентрацию РНК определяли спомощью набора molecular probes, Life technologies, USA) на приборе Qubit 2.0,invitrogen, США.2.3.6 Обратная транскрипцияПосле обработки суммарной выделенной РНК ДНКазой проверялиотсутствие ДНК в пробах методом ПЦР, затем проводили реакцию обратнойтранскрипции для получения кДНК на матрице мРНК. Случайные праймеры(Random primers, Invitrogen) смешали с дезоксинуклеотидтрифосфатами (10mM dNTP Mix, Invitrogen) и суммарной РНК, затем инкубировали 5 минут при65°С и 1 минуту на льду. В полученную смесь добавили 5-x буфер,дитиотреитол, обратную транскриптазу (Superscript III Reverse transcriptase,Invitrogen) и ингибитор РНКаз (RNaseOUT, Invitrogen).

Инкубировали 5 минутпри 25°С, 1 час при 50°С и 15 минут при 75°С. Полученную кДНК хранили при-80°С.602.3.7 Количественная ПЦР в режиме реального времениДля оценки уровня мРНК генов использовали праймеры представленные втаблице 9. Для проведения ПЦР-РВ использовали ПЦР-смесь 2FRT,содержащую ионы Mg2+ (Amplisens, Москва); термостабильную ДНКполимеразу TaqF (Amplisens, Москва); 25-кратную смесь нуклеотидов (ThermoScientific, США); 20-кратный интеркалирующий краситель EVAGreen (Biotium,США); референсный краситель ROX (Синтол, Россия); синтезированныепраймеры для целевых и контрольных генов.

Приготовленные реакционныесмеси по 8 мкл вносили в 96-луночный планшет, после чего добавляли вкаждую лунку по 2 мкл (~10 нг) матрицы (кДНК) и плотно закрывали планшетпленкой. Каждая проба имела три повторности. ПЦР-РВ проводили на прибореApplied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Life Technologies, США) сиспользованием программного обеспечения RQ (Relative Quantitation software,Life Technologies, США).

Использовали следующий температурный режим:предварительная денатурация и активация фермента при 95°C в течение 15мин. (по протоколу производителя для TaqF ДНК-полимеразы); 50 циклов:денатурация - 15 сек. при 95°C, отжиг праймеров и зонда, элонгация - 1 мин.при 60°C.Полученные данные анализировали с использованием контрольных генов иотносительного количественного или ΔΔCt-метода. Относительный уровеньмРНК (R) рассчитывался по формуле:2-ΔΔCT, гдеΔΔCT = (СTопыт1 – СTконтр1) – (СTопыт2 – СTконтр2)Опыты были повторены минимум 3 раза.612.4 Биохимические методы2.4.1 Тонкослойная хроматографияДля разделения аминокислот и идентификации ГАМК в культуральнойжидкости исследуемых штаммов проводили тонкослойную хроматографию настеклянных пластинах с тонким закреплённым слоём силикагеля (TLC plates10*20 cm Silicagel 60 F254 Merck).

В качестве растворителя использовали нбутанол, уксусную кислоту и воду в соотношении 4:1:1. Нингидрин добавлялив элюирующую смесь в концентрации 0,2%. Анализируемую смесь наносили спомощью капилляра на линию старта, предварительно разведя её в 20 раз.Разделениеаминокислотпроводиливхроматографическойкамереввертикальном положении, сушили на воздухе при комнатной температуре,затем 20 минут при 80 °С, после чего проявлялись пятна, окрашенныенингидрином. Для измерения количества ГАМК в образцах использовали методдвумерного сканирования пластинок на денситометре Shimadzu CS-930,Япония, который работает по принципу сканирования площади и глубиныокрашивания пятен при длине волны λ=512 нм.2.4.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)Для дериватизации ГАМК смешивали 10 мкл культуральной жидкости,содержащей аминокислоту, с 20 мкл ортофталевого альдегида (OPA) смеркаптоэтанолом (МЭ) (10 мг OPA + 10 мкл 2-MCE + 2,5 мл ацетонитрила) и100 мкл борной кислоты.

Акликвоты (20 мкл) пропускали через фильтры сразмером пор 22 нм и инъецировали в колонку ZORBAX Eclipse XDB-C18,Agilent technologies, США. Использовался хроматографGilson 305 сультрафиолетовыми флуоресцентными детекторами.В качестве подвижной фазы использовали буферы A и B, имеющиеследующий состав:Буфер А: буферный раствор ацетата натрия (0,02 M; pH=7,3); 1,64 г CH3СOONa+ 200 мкл триэтиламина + 20% ацетонитрила.62Буфер B: 100% ацетонитрила.Использовали ацетонитрил классификации «для ВЭЖХ».Дляразделенияаминокислотнаколонкеиспользоваласьследующаяпрограмма: 3 мин –100% буфер А; 15 мин - 60% буфер B; 18 -20 мин - 100%буфер B; 22 - 40 мин - 0% буфер B.Пересчёт концентрации ГАМК в анализируемой пробе проводили с помощьюизмеренияплощади“Мультихром”пикаикалибровочногокомпанииграфикавпрограммеАмперсенд,РФ(http://www.multichrom.ru/Default.aspx?AspxAutoDetectCookieSupport=1).Таблица 9.

Список олигонуклеотидов, использованных в работе.Целевой генНазваниепраймеров16S рРНК27F1492RМежгенныйрайон,предшествующий оперонуF1F0АТФсинтазыуL.caseiМежгенныйрайон,предшествующий оперонуF1F0АТФсинтазыуL.rhamnosusForwardолигонуклеотид,специфиченкrecAгенууL.paraplantarumForwardолигонуклеотид, специфиченк recA гену уL.pentosusForwardолигонуклеотид, специфиченк recA гену уL. plantarumReverseолигонуклеотид, специфиченк recA гену уL. plantarum,L.paraplantarum, L.pentosusНуклеотидная последовательность праймера 5’--->3’для видовой индентификации штаммовAGA GTT TGA TCM TGG CTC AG (Lane, 1991)CGG TTA CCT TGT TAC GAC TTF1F0.L.ca.-FF1F0.L.ca.-RGCGTTAGATGATCATTTGAACTACCAGTAAGAATACCAGAAC(Полуэктова, Даниленко, Способвидовойидентификациилактобацилл)F1F0.L.rh-FF1F0.L.rh.-RCGCTGCACTTGATGATCATTAAGATCGCCGAAACCAATACL.casei/L.paracasei, L.fermentum, L.plantarumиL.rhamnosus, патентРФ№2508406paraFGTC ACA GGC ATT ACG AAA AC(Torriani et al., 2001)pentFCAG TGG CGC GGT TGA TAT C(Torriani et al., 2001)planFCCG TTT ATG CGG AAC ACC TA(Torriani et al., 2001)pREVTCG GGA TTA CCA AAC ATC AC(Torriani et al., 2001)63gadBgadB1gadB2gadBgadBдля поиска гена gadB у штаммов L.plantarumAAC CAG TCT TTG GTG CGC CTGDLp-FTTC AGA GGA GCC AAT CGT AGGDLp-RПриоритет изобретения 01.02.2012для поиска гена gadB1 у штаммов L.brevisTGA GTG CCT TTG TGG TCA TGGDBLb1-FTGTTGTGCCGCCAAACAATCGDBLb1-RДанная работадля поиска гена gadB2 у штаммов L.brevisAAT CTC GCC ACG TTC TGT CAGDLb-FCAT GGG AAC GAC ATG CAT GTCGDLb-RДанная работадля поиска гена gadB у штаммов L.fermentumGAT TGC CTA CCA AGT GGT CAGDRf-FTCC AAC TGA ACT TCA TCG CCGDRf-RДанная работадля поиска гена gadB у бифидобактерийAGG TGT GCT GGG AGA AGT TCgadB-FCCA AAC GCA GGA ACA TGT AGgadB-RДанная работаПраймеры использованные в RT-PCR с ДНК L.plantarumgadBGDLp-FGDLp-R2AAC CAG TCT TTG GTG CGC CTAAC GGC TTC GGG TTC CAT ATДанная работаgadCLpgadC-FLpgadC-RTAA TTG CAT TCG TGG CGG TCCCC AGT TGA CCC ACA ATC AAДанная работаrecALprecA-FLprecA-RCCA GTT GCA TCC ATA CCG TAATG GTG ACG ATC GCA TTG GTДанная работаfeoALpfeoA-FLpfeoA-RfeoBLpfeoB-FLpfeoB-RtrxBLptrxB-FLptrxB-RmubLpmub-FLpmub-RACG ATT GCA CAG CTT AGG GCACG GTG TAC CGA ATC CCA ATДанная работаCGC CCC TGT CAG ATT TGT TATAA AGA CGA GCA CGC CAC CДанная работаGCT TCA CGA GCC AAT CTA TCACC ATA CGC GTA TTC AGC ACДанная работаGGG ACG GAT CTC AGT CCA GACAC TGA CCA GTT CAT AGC CCAДанная работа64ГЛАВА 3.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ3.1 Идентификация и характеристика штаммов лактобацилл, выделенныхиз трёх биотопов человеческого тела.Объектом нашего исследования были лактобациллы и бифидобактерии,выделенные из организма жителей центрального региона России, из коллекциилаборатории генетиики микрорганизмов ИОГен РАН. Коллекция быласформировананапротяжениирядалет;былаопределенавидоваяпринадлежность штаммов наряду с другими их свойствами.

Мы внесли свойвклад в создание этой коллекции, а именно 32 штамма лактобацилл,выделенныеизразличныхбиотоповчеловеческогоорганизма,былиидентифицированы до вида. Идентифицированные штаммы были выделены изтрёх биотопов: из фекалий, слюны и вагинального содержимого 13 женщин жительниц центрального региона России.

Поскольку каждый из этих биотоповпредставляет собой экосистему, характеризующуюся разными факторами (pH,доступ кислорода, питательные элементы), представляло интерес изучить,какие виды лактобацилл приспособлены к различным экологическим нишам.3.1.1 Видовая идентификация изолятов лактобацилл, населяющихкишечник, ротовую полость и влагалище человека.Идентификацияштаммовпроводиласьпоанализунуклеотиднойпоследовательности гена 16S рибосомальной РНК.

Там, где этот метод давалнеоднозначные результаты, были использованы другие видоспецифичныемаркеры:дляразделенияштаммовL.rhamnosusиL.caseiвидоваяпринадлежность была уточнена по ПЦР-реакции с видоспецифическимипраймерами к межгенному району, предшествующему оперону F0F1 АТФсинтазы, для разделения штаммов L.plantarum, L.paraplantarum и L.pentosus –по ПЦР-реакции с праймерами к гену recA (табл.9). Результаты идентификацииштаммов представлены в таблицах 10 и 11.65Таблица 10.

Штаммы лактобацилл, выделенные из трех биотопов.Штамм7677116119131134236237253254277279308309311313316321322339344347357360364369381-1381-2385433439471ВидлактобациллL.rhamnosusL.rhamnosusL.rhamnosusL.plantarumL.caseiL.caseiL.rhamnosusL.rhamnosusL.fermentumL.rhamnosusL.fermentumL.fermentumL.rhamnosusL.fermentumL.fermentumL.rhamnosusL.rhamnosusL.salivariusL.fermentumL.fermentumL.crispatusL.fermentumL.buchneriL.rhamnosusL.buchneriL.fermentumL.buchneriL.gasseriL.rhamnosusL.crispatusL.fermentumL.rhamnosusИсточниквыделенияФекалииСлюнаФекалииСлюнаСлюнаФекалииФекалииСлюнаСлюнаФекалииСлюнаФекалииСлюнаСлюнаФекалииСлюнаВагинальныйВагинальныйВагинальныйФекалииВагинальныйВагинальныйФекалииСлюнаФекалииСлюнаФекалииФекалииСлюнаВагинальныйВагинальныйСлюна66Таблица 11.

Общая характеристика штаммов лактобацилл, выделенных из трехбиотопов тела человека.ВидИсточник выделения штаммалактобациллВагинальныйФекалииСлюнаВсегоL.rhamnosus14712L.fermentum33410L. casei0112L.plantarum0011L.buchneri0303L.salivarius1001L.crispatus2--2-1-17121332L.johnsoniiL.gasseriВсегоВо всех трех биотопах доминировали виды L.rhamnosus и L.fermentum;кроме того, в вагинальном содержимом были обнаружены штаммы L.salivarius,L.crispatus; в фекалиях – штаммы L.casei, L.buchneri, L.johnsonii-L.gasseri; вслюне – штаммы L.casei, L.plantarum.