Диссертация (Адаптивное значение для человека бактерий рода Lactobacillus и рода Bifidobacterium), страница 10

Тверь, РоссияВКПМ no. В-11816;(Klimina et al., 2013;Krugel et al., 2015 )Тверь, (Klimina et al., 2013)Тверь, (Klimina et al., 2013)Тверь, (Klimina et al., 2013;Krugel et al., 2015 )фекалиислюнафекалиифекалиислюнаГБОУ ВПО Тверская ГМА МинздравафекалииРоссии г. Тверь, РоссияслюнаслюнавлагалищеслюнаслюнаслюнафекалиислюнафекалиислюнаГБОУ ВПО Тверская ГМА МинздраваРоссии г. Тверь, РоссиявлагалищеслюнафекалиислюнаслюнаVKPM no. B-12236Типовой штамм, кишечникATCC 53103;(Doron et al., 2005)уретроATCC 55826;(Martinez et al., 2009)L.casei/paracaseiфекалиифекалиифекалииГБОУ ВПО Тверская ГМА МинздравафекалииРоссии г. Тверь, РоссияфекалиислюнаслюнафекалииВКПМ no. B-31905323БТ-24/88GKNM 577NK-1NNIE100HEr 315/40278sk64sk32144st47skRC-14D1F1-1D2F3-146f344433364381-1357381-24444-24848-2565776108110104152174191L.casei/paracaseiфекалииГКНИфекалииВКПМ no.

В-6253фекалииГКНИ no.577Lactobacillus helveticusфекалииВНИИ Молочной промышленности,содержимое кишечникаМосква, Россиясодержимое кишечникасодержимое кишечникаLactobacillus salivariuscодержимое кишечникаГБОУ ВПО Тверская ГМА Минздраваcодержимое кишечникаРоссии г. Тверь, РоссиявлагалищефекалииLactobacillus sakeicодержимое кишечникаГБОУ ВПО Тверская ГМА МинздраваРоссии г. Тверь, РоссияLactobacillus reuteriвлагалищеATCC 55845фекалии ребёнкаЛаборатрная коллекция лабораториигенетики микроорганизмов ИОГен РАНфекалии ребёнкаЛаборатрная коллекция лабораториигенетики микроорганизмов ИОГен РАНLactobacillus mucosaфекалииГБОУ ВПО Тверская ГМА МинздраваРоссии г. Тверь, РоссияLactobacillus crispatusвлагалищеГБОУ ВПО Тверская ГМА МинздраваРоссии г.

Тверь, РоссиявлагалищеLactobacillus buchneriфекалииГБОУ ВПО Тверская ГМА МинздраваРоссии г. Тверь, РоссияфекалиифекалииLactobacillus gasseriфекалииГБОУ ВПО Тверская ГМА МинздраваРоссии г. Тверь, РоссияBifidobacterium adolescentisфекалиифекалиифекалиифекалиифекалиифекалииГБОУ ВПО Тверская ГМА МинздравафекалииРоссии г. Тверь, Россияфекалиифекалиифекалиифекалиифекалиифекалии54277282S11S14150km4km5-1Tv29GT102334-1334-19Bifidobacterium adolescentisфекалииГБОУ ВПО Тверская ГМА МинздравафекалииРоссии г. Тверь, РоссияфекалиифекалииВКПМ no.

АС -1974;фекалии(Dyachkova et al., 2015)Bifidobacterium adolescentisфекалииВКПМ no. AC-2016фекалииГБОУ ВПО Тверская ГМА МинздраваРоссии г. Тверь, РоссияфекалииГБОУ ВПО Тверская ГМА МинздраваРоссии г. Тверь, РоссияBifidobacterium angulatumФекалииГБОУ ВПО Тверская ГМА МинздраваРоссии г. Тверь, РоссияслюнаРотовая полостьBifidobacterium dentiumГБОУ ВПО Тверская ГМА МинздраваФекалииРоссии г. Тверь, Россия2.1.2 Среды и условия ростаЛактобациллы культивировали в среде MRS (HiMedia, Индия; deMan et al.,1960). Бифидобактерии выращивали в среде MRS с добавлением 0,05%цистеина.

Перед тем как использовать штамм, его реактивировали последующей схеме: замороженная культура (-80°C) → чашки (48 часов) →жидкая культура (24 часа) → :100 (24 часа) → рабочая культура. Для проверкиспособности штаммов к синтезу ГАМК, добавляли 1% предшественника ГАМКмононатриевой соли глютаминовой кислоты в питательную среду.Для проверкидействияпиридоксаль-5'-фосфата на синтез ГАМКдобавляли его в концентрации 0,5 мМ в среду MRS на различных стадияхроста.Опыты с катехоламинами и серотонином проводили в минимальной средеSAPI, которая имела следующий состав: 6,25 мМ NH4NO3, 1,84 мМ KH2PO4,3,35 мМ KCl и 1,01 мМ MgSO4.

pH 7,5. После автоклавирования добавляли всреду стерильную глюкозу в концентрации 0,05% и сыворотку крови крупного55рогатого скота (Панэко, Россия) в концентрации 30% (v/v). Нейротрансмиттерыдобавляли в концентрации 100 мкМ предварительно норадреналин (Sigmaaldrich, USA) и адреналин (Sigma aldrich, USA) растворили их в 0,5 М раствореHCl, а дофамин (Sigma aldrich, USA) и серотонин (Sigma aldrich, USA), которыерастворяливводе.Дляобеспечениястерильности,растворынейротрансмиттеров пропускали через фильтры с размеров пор 0,22 микрон ихранили до месяца в виде замороженных аликвот при -20 °С.Для определения действия pH, желчных солей и норадреналина наэкспрессию генов культуру засевали из музея (-80°C) в среду MRS икультивировали 24 часа.

Выросшую культуру пересевали в свежий MRS сразведением в 50 раз. Через 24 часа производили вторичный пассаж в свежийMRS с разведением в 50 раз (200 мл). Через 6 часов роста отбирали по 20 млкультуры и откручивали при 5000g. Супернатант сливали и осадок из каждойпробирки ресуспендировали в таком же объёме свежей среды, но приследующих условиях: MRS pH 6,3; MRS pH 3,5; MRS pH 5; MRS+0,1% желчиpH 6,3; Норадреналин 100 мкМ. Культуру инкубировали в новых условиях 2часа при 37°С, затем отмывали и выделяли тотальную РНК.Для изучения влияния катехоламинов и серотонина на рост штаммовлактобацилл и бифидобактерий, их засевали из музея в свежую среду MRS икультивировали 24 часа. Затем производили вторичный пассаж в свежую средуMRS.

Через 24 часа роста культуру разводили до 104 КОЕ/мл в 0,8% NaCl изасевали (:100) в среду SAPI с добавлением нейротрансмиттеров и без них.Таким образом, конечная концентрация клеток составляла 102 КОЕ/мл. Через 23 суток высевали клетки на чашки Петри с MRS-агаром и подсчитывали числоКОЕ.Подсчёт колониеобразующих единиц производили методом серийныхразведений в 0,8% растворе NaCl с последующим высевом на агаризованнуюсреду MRS в случае лактобацилл и MRS+0,05% цистеина в случаебифидобактерий.56Бактерии выращивали в термостате при 37±0,5°С в течение 24-48 часов.Для выращивания штаммов бифидобактерий использовали газпакеты (BDGasPak TMEZ Anaerobe Container System), обеспечивающие атмосферу,содержащую 10% СО2.2.1.3 Определение вида лактобациллИз исследуемых штаммов была выделена ДНК и использована как матрицав реакции ПЦР с праймерами к гену 16S рибосомальной РНК 27f и 1492r (Lane,1991).

Использовали следующий температурный режим: предварительнаяденатурация и активация фермента 95°C в течение 5 минут; 35 циклов:денатурация - 1 минута при 94°C, отжиг праймеров - 1 минута при 56°C иэлонгация - 1 минута при 72°C. Конечная элонгация 1 цикл -5 минут при 72°C.ПЦР фрагменты разделялись в геле 1% агарозы и были секвенированы поСенгеру. Видовую принадлежность штамма определяли, сравнивая полученнуюнуклеотидную последовательность с помощью алгоритма BLASTnc базойданныхNCBIпогену16SрРНКбактерийиархей(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).2.2 Использованные в работе животныеОпыты на животных проводились на крысах самцах линии Спрэг-Доули.Крысы были получены из питомника лабораторных животных ФИБХ РАН,Пущино.

В течении 15 дней 3 группы крыс (по 10 крыс на группу) получалисоответственно стерильную питательную среду MRS, пробиотичесикй штаммL.rhamnosus GG и штамм L.plantarum 90sk. Первые две группы служиликонтролем. Бактериальные штаммы вводили крысам ежедневно через зонд вколичестве 108 степени КОЕ. Стрессовым фактором служил холодовой шок,индуцированный у крыс в результате снижения температуры до -40°С втечения 45 секунд в последние 10 дней опыта.

После этого крыс умерщвляли иобескровляли для измерения в крови уровня ГАМК и гормона стрессапролактина (рис. 19) с помощью иммуноферментных наборов (ИФА набор Rat57Gamma-amino butyric acid, GABA ELISA kit, C USA BIO BIOTECH Co., LTD.,Китай) и (ИФА набор rat prolactin ELISA Kit, 96, C USA BIO BIOTECH Co.,LTD., Китай) соответственно. Работу проводили совеместно с лабораториеймолекулярной микроэкологии человека ФГБУН НИИ морфологии человека.2.3 Молекулярно-генетические методы2.3.1 Выделение ДНКДНК лактобацилл и бифидобактерий выделяли набором SigmaNA2110 из24 часовых жидких культур в соответствии с инструкцией производителя. ПЦРфрагменты ДНК выделяли из геля агарозынабором ThermoFisher ScientificK0691.2.3.2 Конструирование праймеров и проведение ПЦРПраймеры для гена глютаматдекарбоксилазы (gad) конструировали спомощью программы NCBI/Primer-BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/) для следующих видов лактобацилл и бифидобактерий: Lactobacillusplantarum,adolescentis,Lactobacillusbrevis,BifidobacteriumконсервативнымучасткамLactobacillusangulatumинуклеотидныхfermentum,BifidobacteriumBifidobacteriumdentiumпоследовательностейпогеновсеквенированных штаммов (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) для этихвидов.ПЦР проводили со смесью из набора «PCR core kit» фирмы «Диалат ЛТД»,Россия.

Состав смеси для ПЦР: 10×ПЦР буфер; 2,5 mM ΣdNTPs; DMSO (5%);50 mM MgCl2; олигонуклеотидные праймеры добавляли в количестве 20 пмольна 100 мкл смеси; Taq –полимеразу - 5u/µl. Температурный режим подбирали сучетом длины и состава праймеров. Указанные концентрации являютсяконечными.Праймеры были синтезированы в фирме Синтол (Россия); они представлены втаблице 9.582.3.3 Электрофорез ДНК в агарозном гелеГель-электрофорез ДНК проводили в горизонтальном 1% – 1,5% агарозномгеле (в зависимости от длины амплифицированного ПЦР фрагмента) в трисборатном буфере ТБЕ (состав 10хТБЕ: 0,89M основной трис, 0,89 M борнаякислота, 20 mM ЭДТА, pH 8.0), содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия принапряженности электрического поля 5В/см. Для определения размеровфрагментов ДНК в качестве стандартов использовали ДНК-маркеры фирмыThermo Scientific, США.2.3.4 Секвенирование ДНКСеквенирование фрагментов ДНК по методу Сенгера было проведено вНаучно-исследовательском институте физико-химической медицины ФМБАРоссии (Москва) с помощью набора реактивов BigDye® Terminator v3.1 CycleSequencing Kit (Applied Biosystems, USA) с последующим анализом продуктовреакции на автоматическом секвенаторе 3730xl DNA Analyzer (AppliedBiosystems, USA).