Диссертация (1154512), страница 13
Текст из файла (страница 13)
При клонированиигенов в клетках Corynebacterium glutamicum оба они были необходимы дляполучения максимального количества ГАМК (Shi et al., 2013). Однако описанштамм L.brevis NCL912, продуцирующий значительное количество ГАМК, укоторого не был обнаружен ген gadB2 (Li et al., 2013).Анализ наличия генов gad в базе данных NCBI показал, что эти геныширокораспространенысредиштаммовлактобацилл,свойственныхмикробиоте кишечника человека (L.plantarum, L.brevis, L.reuteri, L.fermentum,L.oris), а также встречается в единичных штаммах еще 25 видов лактобацилл(L.buchneri, L.helveticus, L.zymae, L.sakei, L.amylovorusи других). Убифидобактерий эти гены распространены меньше, они встречаются у многихвидов B.adolescetis, B.angulatum, B.dentium и у отдельных штаммов видовB.stercoris,B.moukalabense,B.subtile,B.ruminantium,B.catenulatum,B.merycicum.
Совокупность данных свидетельствует о том, что gadBC геныотносятся к вариабельной части генома и способны передаваться между74видами путем горизонтального переноса, а также делетироваться из геномов.Результаты работы свидетельствуют, что способность синтезировать исекретировать в среду ГАМК широко распространена среди лактобацилл,бифидобактерий микробиоты человека.3.2.4 Характеристика синтеза ГАМК у 4-х штаммов бактерий, отобранныхв качестве пробиотиков.Для подробных исследований были отобраны два штамма лактобацилл идва штамма бифидобактерий, которые предполагалось использовать вбудущем в качестве пробиотиков. Это штаммы Lactobacillus plantarum 90sk,Lactobacillus brevis 15f, Bifidobacterium angulatum GT102 и Bifidobacteriumadolescentis 150.
Отобранные штаммы синтезировали наибольшое количествоГАМК для своего вида и характеризовались пробиотическими свойствами(высокойантагонистическойпатогеннымштаммамактивностьюбактерий,апотакжеотношениювысокойкусловно-антиоксидантнойактивностью).Были изучены динамика синтеза ГАМК в среде MRS и влияниедобавлениякофактораферментаглутаматдекарбоксилазы,пиридокальфосфата, для четырёх отобранных штаммов.75Рисунок 7. Хроматография культуральной жидкости штамма L.plantarum 90skв различные временные точки.
Указано время роста культуры в часах.Log числа КОЕ 10ПродукцияГАМК,мкг/мл2101801501209060300864200Log КОЕ/млC мкг/мл8 32 56 88 136 160 184Время роста культуры в часахРисунок 8. Продукция ГАМК штаммом L. plantarum 90sk.Как видно из рисунков 7 и 8, ГАМК начинает синтезироваться штаммомLactobacillus plantarum 90sk через 8 часов и достигает максимума через 88часов (210 мкг/мл).76Log числаКОЕ10800700600500400300200100086420ПродукцияГАМК,мкг/млLog КОЕ/млС мкг/мл025 50 75 100 125Время роста культуры в часахРисунок 9.
Продукция ГАМК штаммом L. brevis 15f.У штамма L.brevis 15f максимальное количество синтезируемой ГАМКбыло достигнуто через 96 часов (675 мкг/мл) (рис.9). Для подтверждения того,что тестируемый в опытах по тонкослойной хроматографии на силикагелепродукт является ГАМК, с культуральной жидкостью штамма L.brevis 15fбыла поставлена ВЭЖХ; контролем служила ГАМК. Результаты приведены нарис. 10.Рисунок 10. Хроматограммы культуральной жидкости штамма L.brevis 15fчерез сутки роста (А) и после трёх суток роста (Б).77Log числаКОЕ10ПродукцияГАМК,мкг/мл40003500300025002000150010005000864200Log КОЕ/млС мкг/мл255075100 125Время роста культуры в часахРисунок 11. Продукция ГАМК штаммом B.angulatum GT102.Штамм B.angulatum GT102 дорастал до стационарной фазы за 24 часа,после чего численность культуры стремительно падала до полного еёотмирания через 96 часов, в отличие от штаммов L.plantarum, гдежизнеспособность сохранялась до 184 часов роста.
ГАМК начиналасинтезироваться через 12 часов и достигала плато примерно через 48 часов(3052 мкг/мл), после чего продолжала детектироваться в среде и после гибеликлеток (рис.11).Log числа КОЕ10500084000630004200021000000204060время роста культуры в часахПродукцияГАМК,мкг/млLog КОЕ/млС мкг/мл80Рисунок 12. Продукция ГАМК штаммом B.adolescentis 150.78ГАМК начинала синтезироваться у штамма B.adolescentis 150 через 8часов роста. Накопление ГАМК в среде достигло максимальных значенийчерез 48 часов (5600 мкг/мл), что совпадает со стационарной фазой ростакультуры (рис.12).Таким образом, все исследованные штаммы начинали синтезироватьГАМК через 8 часов роста; количество ГАМК достигало максимум через 48часов (бифидобактерии) и 90 часов (лактобациллы).Пиридоксаль-5-фосфат (витамин B6, PLP) является кофактором всехисследованныхглютаматдекарбоксилаз(PercudaniandPeracchi,2003).Представляло интерес установить, насколько добавление кофактораповышаетпродукциюГАМКучетырёхотобранныхштаммов.Предварительные опыты показали, что концентрация 0,5 мМ являетсяоптимальной для усиления активности декарбоксилирующего фермента.ПродукцияГАМК, мкг/мл12009006003000024487296120Контрольбез PLPВремя внесения пиридоксальфосфата (0,5 мM) от моментазасева культуры в часахРисунок 13.
Влияние добавления кофактора пиридоксаль-5-фосфата (PLP) насинтез ГАМК штаммом L.plantarum 90sk. Культуру выращивали 144 часа.Как видно из рисунка 13, добавление PLP к культуре L.plantarum 90sk призасеве культуры, т.е. на первой стадии роста (лаг-фаза), не приводило кувеличению количества ГАМК (201 мкг/мл) в культуральной жидкости по79сравнению с контролем без добавления PLP (207 мкг/мл). Добавление PLP наранней стационарной фазе (24 ч.) стимулировало активность ферментанезначительно (260 мкг/мл). Максимальное увеличение (843 мкг/мл) ГАМКбыло достигнуто при добавлении PLP на поздней стационарной фазе (72 ч.).Объяснением этому может быть утилизация PLP на ранней стадии ростакультуры на энергетические нужды клеток или разложение PLP в среде ростапри культивировании.ПродукцияГАМК,мкг/мл5004003002001000024487296120Контрольбез PLPВремя внесения пиридоксальфосфата (0,5 мМ) от моментазасева культуры в часахРисунок 14.
Влияние добавления кофактора пиридоксаль-5-фосфата (PLP) насинтез ГАМК штаммом L.brevis 15f.80ПродукцияГАМК,мкг/мл3000200010000Контрольбез PLP0244872Время внесения пиридоксальфосфата (0,5 мМ) отмомента засева культуры в часахРисунок 15. Влияние добавления кофактора пиридоксаль-5-фосфата (PLP) насинтез ГАМК штаммом B.angulatum GT102.ПродукцияГАМК,мкг/мл600045003000150000244872контрольбез PLPВремя внесения пиридоксальфосфата (0,5 мМ) отмомента засева культуры в часахРисунок 16. Влияние добавления кофактора пиридоксаль-5-фосфата (PLP)на синтез ГАМК штаммом B.adolescentis 150.81Добавление PLP не вызывает увеличения количества ГАМК в среде уштамма L.brevis 15f (рис.14). Возможно, у данного штамма существуетпрочная связь апофермента с кофактором, и глютаматдекарбоксилазехватает минимальных количеств кофактора, присутствующих в среде роста.ЧтокасаетсядвухштаммовBifidobacteriumangulatumGT102,Bifidobacterium adolescentis 150, добавление кофактора PLP не оказалозаметного влияния на синтез ГАМК.
Возможно, это связано с тем, чтобифидобактерии сами способны синтезировать PLP. Данные приведены нарисунках 15 и 16.3.2.5 Характеристика генов, обусловливающих синтез ГАМК.Целью данного раздела была изучение структуры gad-оперонов упредставителей разных видов лактобацилл и бифидобактерий. gad-оперонывидовL.plantarum,B.adoslescentisиB.angulatumпрактическинеохарактеризованы в литературе. gad-оперон у вида L.brevis описан влитературе (Li et al., 2013), но представляло интерес сравнить его структуруу описанных штаммов и у отобранного нами штамма L.brevis 15f. Для этогоДНКштаммов,отобранныхкакпотенциальныепробиотики,быласеквенирована.
Сиквенс был проведён К.М. Климиной. Резуьтаты поискагенов, определяющих синтез ГАМК у данных штаммов, предоставлен втабл. 15 и на рис. 16.82Таблица 15. Гены, участвующие в синтезе ГАМК у лактобацилл ибифидобактерий.ГеныL. plantarum 90skГлутаматдекарбоксилазаLpsk_RS08640Глутамат/ГАМКантипортерТранскриционныйрегуляторГлутамил-тРНК синтетазаLpsk_RS09715L. brevis 15fLb15f_RS06400gadB1Lb15f_RS01170gadB2Lb15f_RS06395B. angulatum B.adolescentisGT102150Bang102_RS02485Bang102_RS02490AAX71_RS09270AAX71_RS09275Lb15f_RS06390Lb15f_RS06400Рисунок 17. Структурная организация gad-оперонов штаммов L.plantarum90sk (A), L.brevis 15f (Б) и B.angulatum GT102 (В) и B.adolescentis 150 (Г);gadB, ген глутамат декарбоксилазыB; gadA, ген глутаматдекарбоксилазы А;gadC, ген антипортера глутамат/ГАМК; gadR, транскрипционный регуляторгенов gad CA; gts, ген глутамил тРНК синтетазы.83У L.brevis были известны гены участвующие в синтезе ГАМК (De Biaseand Pennacchietti, 2012).
Эти гены также были идентифицированы у L.brevis15f.Для B.angulatum GT102 и B.adolescentis 150 можно предположитьналичие оперона из расположенных рядом генов глютаматдекарбоксилазы иантипортера. У L.plantarum90skрядом сgadB геном нетгена,соответствующего антипортеру; ген, чей белок имеет гомологию сантипортеромL.brevis(25%)ианнотируетсякакаминокислотныйтранспортер расположен в другом месте хромосомы и можно предположить,что именно он - антипортер, хотя окончательных доказательств пока нет (рис.17).Увсех4-хштаммовмынашлиген,кодирующийферментглутаматдекарбоксилазу gadB и ген, кодирующий антипортер gadC, чтоговорит о важности этих генов для синтеза и транспорта ГАМК. Гены gadB иgadC следовали друг за другом во всех случаях, кроме штамма L.plantarum90sk, где они находились на расстоянии друг от друга.Мы хотели выяснить отличаются ли отобранные нами штаммылактобацилл и бифидобактерий по строению генов/белков gadB/С отописанных в других работах.
Для этого мы сравнили аминокимлотный составэтихбелковунашихштаммовиштаммовизGenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Уникальные замены могут служитьмаркерами для идентификации и типирования штаммов лактобацилл ибифидобактерий.84Таблица 16. Уникальные замены в аминокислотных последовательностяхбелков, участвующих в синтезе и транспорте ГАМК у L.plantarum 90sk,L.brevis 15f, B.angulatum GT102 и B.adolescentis 150.ГенбелокgadГлутаматдекарбоксилазаПредполагаемыйГлутамат/ГАМКантипортерgadCКоличествовыровненныхпоследовательностейL.plantarum 90skУникальныеаминокислотныезамены в белкеВеличинабелка8D341/G470 ак6E2/A479 акL.brevis 15fE7/GI141/VgadCГлутамат/ГАМКантипортерV247/IN266/S4505 акG289/SV291/IA369/SgadAГлутаматдекарбоксилаза AD38/NT234/M6480 акE437/KgadBГлутаматдекарбоксилазаБA224/V6469 акB.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
