Диссертация (1154512), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Исследованные впредыдущем разделе штаммы L.plantarum 90sk, L.brevis 15f, B.angulatum GT102и B.adolescentis 150 также реагировали на добавление катехоламинов, особеннозначительной была реакция штамма L.plantarum 90sk. Стоит отметить штаммы,дававшие значительное увеличение роста для всех 4-х использованныхсоединений: L.rhamnosus 51gn и B.adolescentis 48. Штамм B.adolescentis km-4отличался тем, что хорошо рос (до 107 КОЕ) в данных условиях и бездобавления катехоламинов и серотонина.Различия наблюдались также между видами, например, штаммы видовL.plantarum хуже росли в среде SAPI, чем штаммы видов L.rhamnosus иL.fermentum (табл.
18).Чтокасаетсяостальныхвидовлактобациллибифидобактерий, то тенденции усиления роста катехоламинами сохраняются,хотя трудно сделать общие выводы ввиду малого числа исследованныхштаммов.Предполагается, что действие катехоламинов на рост лактобацилл ибифидобактерий связано с их способностью восстанавливать Fe(III) до Fe(II),формой железа, обладающей меньшей афинностью к трансферрину илактоферрину сыворотки крови среды, тем самым делая железо доступным длябактериальных клеток (Bailey et al., 2011). Что касается действия серотонина нарост, возможно, серотонин участвует в quorum sensing у лактобацилл ибифидобактерий, как это было показано для штамма Pseudomonas aeruginosaPAO-1 (Knecht et al., 2016).
Такие штаммы, как B.adolescentis km-4, способныерасти в среде SAPI без добавления нейротрансмиттеров, возможно, имеютсобственные системы захвата железа, например, через синтез энтеробактина идругих сидерофоров.1073.3.3 Изучение влияния норадреналина на транскрипционную активностьгенов L.plantarum 90sk методом ПЦР в реальном времени.В предыдущем разделе нами было показано, что штаммы лактобацилл ибифидобактерий способны реагировать на присутствие катехоламиновусилением роста. Особо выраженным было влияние норадреналина на штаммL.plantarum 90sk, чей рост увеличивался на 4 порядка. Было поэтому изученовлияние норадреналина на транскрипционную активность ряда генов уштамма L.plantarum 90sk.
Были выбраны гены, вовлечённые в процессы,потенциально стимулируемые норадреналином (Graziano et al., 2014; Dowd etal., 2007): гены транспорта железа (feoA, feoB), гены антиоксидантнойактивности (trxB, gshAB) и гены адгезии (mub, ccpA).feoA и feoB кодируютбелки, транспортирующие ионы железа внутрь клетки. trxB, gshAB кодируюттиоредоксин и глютатион соответственно. mub кодирует белок-факторадгезии.ГенccpAкодируетбелок,ингибирующийтранскрипциюкатаболитных генов. Его активность считается одним из маркеров образованиябиоплёнок. Результаты приведены на рисунке 34.108Относительнаяэкспрессия2,521,510,50контрольfeoAfeoBmubtrxBРисунок 34.
Экспрессия генов штамма L.plantarum 90sk, в присутствиинорадреналина. feoA, feoB – гены транспорта железа A и B, trxB – гентиоредоксин редуктазы, mub – ген адгезии, recA – контрольный ген.Норадреналин достоверно стимулировал транскрипционную активностьгенов, участвующих в транспорте железа (feoA, feoB), антиоксидантнойактивности (trxB) и адгезии (mub) у штамма L.plantarum 90sk.
Влияниянорадреналина на транскрипционную активность генов gshAB и ccpA не было.В дальнейшем планируется проведение транскриптомного анализа дляидентификациигеновлактобацилл,реагирующихнанорадреналин,вчастности, предполагаемых генов рецепторов, вовлечённых в узнаваниинорадреналина.Активация генов feoA и feoB согласуется с данными раздела (см.литературный обзор) об участии НА в транспорте железа в клетки бактерий.Активация двух других генов говорит о более широком влиянии норадреналинана метаболизм клетки. Для функционирования L.plantarum 90sk в ЖКТ важнаактивация генов адгезии, т.е. генов, обусловливающих прикрепление бактерийк стенке кишечника.
Возможно, при увеличении концентрации НА в ЖКТпроисходит активация генов, участвующих в адгезии, что способствует лучшейадаптации L.plantarum.109В литературе описано влияние норадреналина и адреналина на экспрессиюгенов преимущеcтвенно у патогенных бактерий. К таким бактериям относятсяэнтерогеморрагическая E.coli, Porphyromonas gingivalis, Salomonella enterica,Streptococcus penumoniae, Haemophilus influenzae, C.rodentium, Pseudomonasaeruginosa и другие. Влияние норадреналина и адренлина выражается вактивации генов вирулентности (гены гемагллютнации, протеолиза, фимбрий,адгезиновбиосинтезаилипополисахаридов),глютатиона,биоплёнкообразования(геныантиоксидантнойтиоредоксина,синтезаактивностилинолевойвнеклеточного(геныкислоты),полисахаридногоматрикса), метаболизма сахаров (гидролазы, галктокиназа, пируват оксидаза) ижелеза (гены транспорта железа и восстановления трёхвалентной формы додвухвалентной) (Graziano et al., 2014). Данные по влиянию нейротрансмиттеровна экспрессию генов у лактобацилл отсутствуют.Полученные нами результаты говорят о том, что НА увеличиваеттранскрипционную активность также и генов лактобацилл (L.plantarum 90sk) –т.е.
подобные симбиотические бактерии в стрессовых условиях могут составитьконкуренцию патогенам.110ЗАКЛЮЧЕНИЕВ работе были исследованы штаммы лактобацилл и бифидобактерий (144в одной части работы и 61 – в другой). Показано, что исследованные бактерииспособны синтезировать и секретировать в среду ГАМК – основной тормозноймедиатор нервной системы человека. В наших опытах это свойство быловидоспецифичным и присущим всем штаммам видов L.plantarum, L.brevis,B.adolescentis, B.angulatum, B.dentium, всего 58 штаммам; по литературнымданным, это свойство может быть обнаружено и у отдельных штаммов другихвидов.
Количество секретируемой ГАМК колеблется в широких пределах,однако оно ниже, чем у штаммов лактобацилл, выделенных из пищевыхпродуктов. Опыты по введению штамма-продуцента ГАМК животным,находящимся в условияхстресса, показали, что в крови животныхувеличивается количество ГАМК и уменьшается - гормона пролактина. Более80% проверенных штаммов реагировали усилением роста (в 10-104 раз по числуКОЕ) на присутствие в среде катехоламинов и серотонина.
Это свойство былоштаммоспецифичным. Для штамма L.plantarum 90sk было показано, чтоадреналин увеличивает экспрессию ряда генов.Подобное исследование большого количества штаммов лактобацилл ибифидобактерий было проведено впервые. Полученные результаты позволяютутверждать,чтоГАМК,катехоламиныисеротонинучаствуютвкоммуникации бактерий-симбионтов (лактобацилл и бифидобактерий) иорганизма человека.
Способность синтезировать ГАМК, и активация роста итранскрипции ряда генов под действием катехоламинов и серотонинаявляются важными свойствами бактерий и должны быть использованы приселекции пробиотических штаммов. Исследованные нами штаммы L.plantarum90sk, L.brevis 15f, B.adolescentis 150, B.angulatum GT102, обладающиеподобными свойствами, являются потенциальными пробиотиками.111ВЫВОДЫ1.
ВвагинальномсодержимомидентифицированыштаммыL.salivarius,L.crispatus; в фекалиях – штаммы L.casei, L.buchneri, L.johnsonii-L.gasseri; вслюне – штаммы L.casei, L.plantarum. Во всех трех биотопах доминироваливиды L.rhamnosus и L.fermentum.2. Большинству исследованных штаммов лактобацилл и бифидобактерий (58 из144штаммов17видов)присущавидоспецифическаяособенность(L.plantarum, L.brevis, B.angulatum, B.adolescentis и B.dentium) синтезировать исекретировать в среду ГАМК (до 5,6 г/л). Добавление кофактора PLP (напоздней стационарной фазе роста) увеличивает продукцию ГАМК в 4 раза уштамма L.plantarum 90sk и не влияет на ее продукцию у штаммов L.brevis 15f,B.angulatum GT102 и B.adolescentis 150.3. У штаммов L.plantarum 90sk, L.brevis 15f, B.angulatum GT102, B.adolescentis150 идентифицированы гены gadB (глютаматдекарбоксилазы) и gadC(ГАМК/глютамат антипортера).
У штаммов L.brevis 15f, B.angulatum GT102 иB.adolescentis 150 они расположены в непосредственной близости (86 – 353пн), у штамма L.plantarum 90sk на значительном расстоянии (513 787 пн) другот друга. В белках GadB и GadC штаммов L.plantarum 90sk, L.brevis 15f,B.angulatumGT102найденыуникальныеаминокислотныезамены,свидетельствующие об отличии белков/генов от идентифицированных ранеегомологов. У штамма L.plantarum 90sk гены gadB и gadC максимальноэкспрессируются в стационарной фазе роста.
Понижение pH среды до 3,5 и 5индуцируеттранскрипционнуюактивностьданныхгенов.ШтаммыL.plantarum 90sk, L.brevis 15f, B.angulatum GT102, B.adolescentis 150 могутбыть использованы для разработки пробиотиков.4. Катехоламины (дофамин, норадреналин, адреналин) и серотонин в солевойсреде с сывороткой крови усиливают рост штамоов лактобацилл и112бифидобактерий на 1-4 порядка у 51 штаммов из 61 проверенного.5. Штамм L.plantarum 90sk реагирует на присутствие норадреналина активациейтранскрипции ряда генов (feoA, feoB, trxB, mub), а также при введении крысамлинии Спрэг-Доули повышает уровень ГАМК и понижает уровень гормонапролактина в крови в условиях холодового шока.113СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕГАМК – Гамма-аминомасляная кислота16S РНК – один из трёх основных типов рибосомальной РНК, образующихоснову рибосом прокариот, находятся в их малой субъединице; константаседиментации равна 16S (единиц Сведберга)MRS (МРС) – питательная среда Мозера-Рогоза-Шарпа для работы с чистойкультурой и для хранения культур лактобациллахНП – нуклеотидные последовательностипн – пар нуклеотидовДНК – дезоксирибонуклеиновая кислотаРНК – рибонуклеиновая кислотаПЦР – полимиразная цепная реакцияПЦР-РВ – полимиразная цепная реакция в режиме реального времениКОЕ – колониеобразующие единицыЖКТ – желудочно-кишечный трактЛФ – лактоферринТФ – трансферринВЭЖХ – Высокоэффективная жидкостная хроматографияPLP – пиридоксаль-5-фосфатАИ – автоиндуктор114СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ1.6-Hydroxydopamine-mediated release of norepinephrine increases faecal excretion ofSalmonella enterica serovar typhimurium in pigs / G.D.
Pullinger, P.M. van Diemen,S.C. Carnell, H. Davies // Veterinary Research. - 2010b. – Vol. 41. – C. 68–80.2.A chloride-inducible acid resistance mechanism in Lactococcus lactic and itsregulation / J.W. Sanders, K. Leenhouts, J. Burghoorn, J.R. Brands JR et al. // MolMicrobiol. – 1998. – Vol. 27.
№ 2. – C. 299-310.3.A glutamate-dependent acid resistance gene in Escherichia coli / B.M. Hersh, F.T.Farooq, D.N. Barstad, D.L. Blankenhorn et al. // J Bacteriol. – 1996. – Vol. 178. – C.3978–3981.4.A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing / J.Qin, R. Li, J. Raes, M.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
