Диссертация (1154512), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Виды L.rhamnosus и L.fermentum можноназватьэкологическивалентнымиилипластичнымиихспособностиадаптироваться к разным экологическим нишам. Виды L.rhamnosus иL.fermentum часто встречаются в фекалиях, слюне (Walter, 2008) и содержимомвагинальной полости (Pavlova et al., 2002; Álvarez-Olmos et al., 2004).673.2 Изучение синтеза ГАМК из лабораторной коллекции штаммамилактобацилл и бифидобактерий.3.2.1 Отбор штаммов лактобацилл и бифидобактерий, синтезирующих ивыделяющих в среду ГАМК.Для отбора штаммов лактобацилл и бифидобактерий, способных к синтезуГАМК, была проверена коллекция лаборатории генетики микроорганизмовИОГен РАН (см.
материалы и методы) из 117 штаммов 14 видов лактобацилл и25 штаммов 3 видов бифидобактерий; штаммы были выделены из микробиотыжителей центрального региона России. Всего было проверено 142 штамма.СкринингкультуральнойпроводилижидкостипредшественникомГАМКметодомштаммов,тонкослойнойвыращенныхглутаматомнатрия.вхроматографиисредеСкринигсMRSштаммовбифидобактерий проводили совместно с сотрудником ИОГен РАН ДьячковойМ.С.Таблица 12. Скрининг штаммов лактобацилл и бифидобактерий, способных ксинтезу ГАМК.Вид бактерийLactobacillus fermentumLactobacillus rhamnosusLactobacillusplantarumLactobacillusbrevisLactobacilluscaseiLactobacillushelveticusLactobacillussalivariusLactobacillussakeiLactobacillusreuteriLactobacillusmucosaLactobacillus crispatusLactobacillusbuchneriLactobacillusgasseriLactobacillusdelbrueckiiBifidobacterium adolescentisBifidobacteriumangulatumBifidobacteriumdentiumВсегоКоличествопроверенных штаммов2428303122413123122131144Количествоштаммовпродуцентов ГАМК00303000000000021315868Способность синтезировать и секретировать в среду ГАМК обнаружиласьу 60 штаммов; эта способность, по нашим данным, видоспецифична иобнаружена у всех проверенных штаммов видов L.plantarum (30 штаммов),L.brevis (4 штамма), B.adolescentis (21 штамм), B.angulatum (3 штамма),B.dentium (1).
Штаммы видов L.fermentum, L. rhamnosus, L.casei, L.helveticus,L.salivarius, L.salvei, L.mucosa, L.crispatus, L.gasseri, L.debrueckii ГАМК несинтезируют. У штаммов видов L.buchneri и L.reuteri в проверенных штаммахмы не обнаружили синтеза ГАМК, однако в ряде статей отмечен синтез ГАМКу штаммов данных видов (Cho et al., 2007; Lin, 2013).3.2.2 Определение количества ГАМК, синтезируемой лактобациллами ибифидобактериями.Количество синтезируемой ГАМК в культуральной жидкости определялиметодомдвумерногосканированияхроматографическихпластинок.Результаты представлены в таблице 13.69Таблица 13.
Количество ГАМК, синтезированной штаммами лактобацилл и бифидобактерий (лактобациллывыращивали 3 суток; бифидобактерии - 2 суток)Продукциямкг/млLactobacillus plantarum119 sk99106 zv368-PA-310590 sk21029sk25746sk6275sk1932sk184K9L78CS3967436st3029st646k110191g13350st 387K131843/517643/418543/39243/2101ШтаммыГАМК,Продукциямкг/мл42/212038/14719/1A3214/4277/1683/16657/114956/110452/16850/213Lactobacillus brevis47st10052st5015f675Bifidobacterium adolescentis56195730237685044230244-22966483090ШтаммыГАМК,Продукциямкг/мл48-2205210891617423415056111102130152501627728871047821912572821489Km42765Km5-14942S142333S11854Tv29441Bifidobacterium angulatumGT1023469334-126162123214Bifidobacterium dentium92465ШтаммыГАМК,70Способность к синтезу ГАМК варьировала в пределах одного вида ибыла относительно низкой для лактобацилл; у штаммов вида L.plantarumона не превышала 257 мкг/мл, у штаммов вида L.brevis количествосинтезируемой ГАМК было максимальным у штамма L.brevis 15f,способного синтезировать до 675 мкг/мл.
Продукция ГАМК штаммамиBifidobacterium adolescentis достигала значительно больших величин (до5600 мкг/мл), но также варьировала в широких пределах. В целом, штаммырода Bifidobacterium были более эффективными продуцентами ГАМК, чемлактобациллы; возможно, разница в способности продуцировать ГАМКразнымиштаммамилактобациллибифидобактерийобусловленаактивностью фермента глутаматдекарбоксилазы, которая может зависеть отмутации в последовательности гена, кодирующего фермент.Лактобациллы, выделенные из продуктов питания (сыров, йогуртов,заквасок, традиционных продуктов корейской и китайской кухонь kimchi иpaocai), демонстрировали высокий уровень синтеза ГАМК. Максимальноеколичество ГАМК – 129 г/л - было получено у штамма L.buchneri WP2001(Zhao et al., 2015).
Для L.brevis максимальное количество ГАМКдемонстрировали штаммы NCL912 и K203, 35,6 и 44,4 г/л соответственно (Liet al., 2010; Binh et al., 2014). Для L.plantarum наибольшее количество ГАМКсоставило 0,5 г/л (DiCagno et al., 2010) и 1,16 г/л для штамма, содержащегодополнительный клонированный на плазмиде ген gadB (Tajabadi et al., 2015).Продукция ГАМК штаммами лактобацилл и бифидобактерий, выделеннымииз организма человека, была описана только в статье Barrett et al., 2012 исоставила 32 г/л для L.brevisи 2,0 – 8,6 г/л для B.infantis, B.angulatum,B.dentium.71Результаты свидетельствуют, что способность синтезировать в средуГАМК широко распространена среди лактобацилл, бифидобактерий микробиотычеловека.
Среди выделенных нами штаммов наблюдался значительный разброс вколичестве синтезируемой ГАМК. Для L.plantarum эти цифры были сходны стеми, что были получены для штаммов, выделенных из продуктов питания, дляL.brevis они были ниже; наибольшее количество ГАМК продуцировали штаммыбифидобактерий (B.angulatum, B.adolescentis, B.dentium, - до 6 г/л. В целом,лактобациллы выделенные из организма человека, синтезируют меньшееколичество ГАМК, чем выделенные из пищевых продуктов. Возможно, этоимеет физиологическое значение.3.2.3 Наличие генов глютаматдекарбоксилазы у штаммов лактобацилл ибифидобактерий.У исследуемых штаммов, методом полимеразой цепной реакции былоопределено присутствие гена gad, кодирующиего фермент глутаматдекарбоксилазу,ответственный за синтез ГАМК. Были сконструированы олигонуклеотидныепраймеры к гену gad (см. материалы и методы), L.plantarum, L.fermentum, L.brevis,B.adolescentis, B.angulatum, B.dentium.
При конструировании олигонуклеотидов мыисходили из нуклеотидной последовательности gad генов секвенированныхштаммов из GenBank и выбирали консервативные участки в секвенированныхпоследовательностях гена gad разных штаммов одного вида. Выравнивали иконструировали праймеры по консервативным участкам генов. Полученныепраймеры использовали в реакции ПЦР на матрице хромосомной ДНК.
Ни у одногоиз штаммов L.rhamnosus и L.casei из GenBank не было генов gadB; для этих видовмы не смогли сконструировать праймеры и не проверяли штаммы данных видов.Мы не проверяли также виды лактобацилл, представленные в коллекцииединичными штаммами.72Таблица 14. Наличие гена gadB штаммов различных видов лактобацилл ибифидобактерий.Вид бактерийКоличество проверенных Наличиегенаштаммовданным ПЦРL.
fermentum249L. plantarum3131L. brevis44B. adolescentis2121B. angulatum32B. dentium11поРезультаты представлены в таблице 14. У всех ГАМК-продуцирующихштаммов, кроме B.angulatum 212, удалось амплифицировать ген gad.Отрицательный результат для данного штамма, скорее всего, указывает не наотсутствие гена, а на наличие мутации в области отжига праймеров. Стоитотметить,чтоналичиегенане всегдасовпадалососпособностьюсинтезировать ГАМК, так как некоторые штаммы L.fermentum содержали генgadB, хотя не были способны к синтезу ГАМК. Может быть, это связано снеобходимостью оптимизировать условия ферментации для штаммов этоговида, или с неактивным состоянием гена. Основными продуцентами ГАМКявляются лактобациллы.
Основными продуцентами ГАМК среди лактобациллявляются L.plantarum, L.brevis (Dicagno et al., 2010; Ko et al., 2013). Естьхорошо изученные виды лактобацилл, для которых никогда не была показанапродукция ГАМК (например, L.fermentum). У многих видов (L.buchneri,L.casei, L.paracasei, L.rhamnosus, L.delbrueckii) синтез ГАМК осуществляетсяотдельными штаммами (Cho et al., 2007; Komatsuzaki et al., 2005; Lin et al.,2013; Siragusa et al., 2007; Seok et al., 2008). Для бифидобактерий этот вопросизучен значительно меньше. Показано, что продуцентами ГАМК являютсявиды B.infantis, B.angulatum, B.dentium, B.adolescentis (Barrett et al., 2012).73Для синтеза и экспорта ГАМК бактериям необходимо наличие геновgadB и gadC. У L.plantarum 90sk в непосредственной близости от гена gadотсутствует ортолог гена glutamate: gamma-aminobutyric acid antiporter.
Средибелковой базы данных NCBI только два белка (WP_063488772 иKZU49776)двух штаммов L.plantarum имеют более 70% идентичности с GadC L.brevis, уостальных идентичность не превышает 25%. Белок L.plantarum 90sk, которыйможетбытьназванортологомGadCL.brevis,кодируетсягеном,расположенным на значительном расстоянии от гена gadB. Наиболее сложноорганизованы gad гены у L.brevis. Анализ 17 секвенированных геномовL.brevis из GenBank (на 29.6.16) показал, что у 14 штаммов есть гены gadB1 иgadB2, а также ген gadC – как и у штамма L.brevis 15f; у одного штамма (EW)есть три гена глютамат декарбоксилазы и ген gadC, у 2-х штаммов (ATCC27305 и BM-BL-13908) нет ни одного гена глютаматдекарбоксилазы, нет игена антипортера. Клонирование генов gadB L.brevis показало, что активносинтезируют ГАМК как ген gadB1 (Hiraga et al., 2008; Li et al., 2013), так и генgadB2 (Park, Oh, 2007; Fan et al., 2012; Seo et al., 2013).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
