Диссертация (Адаптивное значение для человека бактерий рода Lactobacillus и рода Bifidobacterium), страница 7

Предположение о том, чтопридоксаль фосфат является кофактором всех декарбоксилаз было сделановпервые (Umbreit et al., 1945). В 1960 был описан метод выделения ферментаGAD высокой степени очистки (90%) (Shukuya et al., 1960). Зависимостьфермента GAD от кофактора пиридоксальфосфат была окончательно доказана(Mardashev et al., 1964; Lawson et al., 1967). Ген gad, кодирующий ферментGAD, был картирован у E.coli, а также была изучена регуляция его активности(Halpern et al., 1961; Marcus et al., 1967).В конце 1980-х была получена кристаллическая решётка фермента былаполучена (Markovic-Housley et al., 1987).

В 1990-х был проведён сравнительныйанализ аминокислотной и нуклеотидной последовательностей фермента GAD игена gad у разных видов, и было сделано заключение об общностипроисхождения фермента у разных организмов (Maras et al. 1992, and Smith etal. 1992).34Сегодня фермент GAD выделен, очищен и охарактеризован для видовLactobacillus sakei, Lactobacillus brevis, Lactobacillus paracasei, Lactococcuslactis, Aspergillus oryzae, Escherichia coli, Streptococcus salivalivarius spp.thermophilus. Оптимальная температура для активности фермента GAD улактобацилл находится в диапазоне 33-55°C; оптимальный pH находится вдиапазоне 4.2-5.2.

Константа Михаэлиса, которая показывает оптимальнуюконцентрацию субстрата, при которой скорость реакции составляет половинумаксимальной, находилась в диапазоне 0.51-16 мМ (табл.6). В работе (Ueno etal., 1997) показано, что молекулярный вес фермента GAD у L.brevis IFO12005 иE.coli составил 120 и 300 Кд соответственно; главный вывод авторов, что белокGAD у L.brevis является димером, а у E.coli является гексадимером.Молекулярный вес GAD фермента, выделенного из Lactobacillus paracaseiNFRI 7415, составил 120 Кд; белок является димером.

В работе (Seo et al., 2013)была продемонстрирована способность CaCl2 активировать феремент GAD,выделенныйизLactobacillusbrevis877G.Добавлениесульфат-йоновиндуцирует работу фермента GAD у L.brevis IFO12005 (Ueno et al., 1997);эффект зависит от дозы.35Таблица 6.

Характеристика фермента GAD, выделенного из разных штаммовбактерий.Вид бактерийLactobacillus sakei A156Lactobacillus brevis 877GLactobacillusbrevisIFO12005Lactobacillus brevis CGMCC1306Lactobacillus paracasei NFRI7415Lactococcus lactis spp. Lactis01-7Lactobacillus plantarumAspergillus oryzaeEscherichia coliStreptococcus salivarius spp.Thermophilus Y2Оптимальнаятемпература(°C)5545ОптимальныйpHKmСсылки(mM)55.216.03.6Sa et al., 2015Seo et al., 2013304.29.3Ueno et al., 1997484.810.3Fan et al., 2012505.0-Komatsuzaki et al.,2008-4.70.51Nomura et al., 19994060-4.54.422.813.31.4Shin et al., 2014Tsuchiya et al., 2003Fonda, 1985554.02.3Lin et al., 2009Основной ген, кодирующий фермент GAD глутаматдекарбоксилазу,называют gadA или gadB.

Для протекания реакции декарбоксилированиятребуется антипортер, кодируемый геном gadC, обеспечивающий проходвнутрь клетки через мембрану глютамата и выхода гамма-аминомаслянойкислотывпротивоположномнаправленииизклеткипоследекарбоксилирования её предшественника GAD ферментом (Sanders et al.,1998; Small & Waterman, 1998). Субстратом для синтеза ГАМК являетсяглутаминовая кислота, а кофактором – пиридоксальфосфат.

Принцип работысистемы декарбоксилирования глутамата следующий: глутамат с суммарнымзарядом 0 переносится электрогенным L-глутамат/ГАМК антипортером GadCвнутрь клетки, затем декарбоксилируется ферментом GadA/B присоединяяодин внутриклеточный атом водорода H+ и образуя молекулу CO2, после чегомолекула ГАМК с суммарным зарядом +1 экспортируется из клеткиантипортером GadC создавая протонодвижущую силу (рис. 4).36Рисуннк 4.

Схема работы антипортера GadC в условиях низкого pH (De Biase,2012).Гены gadB и gadC обычно образуют оперон и встречаются у архей,бактерий, грибов и эукариот. E.coli была одним из первых микроорганизмов, укоторых обнаружили два gad гена, и их обозначили gadA и gadB. Гомология ихнуклеотидных последовательностей составляет 98%. Гены gadA и gadBнаходятся на расстоянии 2,1 Кб друг от друга; gadB ген расположен нахромосоме перед геном gadC, образуя оперон, а ген gadA расположен рядом с13 другими генами, обеспечивающими устойчивость к низким pH, образуя такназываемый "островок устойчивости к низким pH".Штамм L.brevis ATCC367 содержит в своём геноме два гена gadA и gadB,расположенные на хромосоме на расстоянии 1,7 Кб друг от друга. Процентидентичности между их аминокислотными последовательностями сосотавил51%.Транскрипционный регулятор gadR предшествует гену gadC,расположенному непосредственно перед геном gadA.

Все эти три генаобразуют оперонную систему. Ген gadB находится особняком на хромосоме, и37нет данных о том, регулируется ли он транскрипционным регулятором gadR,или нет. У другого штамма L.brevis NCL912, ген gadB вовсе отсутствовал вгеноме, при этом штамм был способен синтезировать до 102 г/л ГАМК (Li etal., 2013).Ген антипортера gadC может находиться на хромосоме как перед геномgadB (Lactococcus lactis IL1403), как и после него (Bifidobacterium dentium Bd1).Оба гена могут следовать друг за другом (Lactobacillus brevis ATCC367) илибыть разделены другими генами и находиться на расстоянии друг от друга нахромосоме (Clostridium perfringens 13), но чаще всего они следуют друг задругом, возможно это имеет значение для их совместной регуляции.

(рис. 5)Рисунок 5. Схема генетических локусов, кодирующих гомологи GadB(тёмные стрелки) и GadC (светлые стрелки) у разных видовбактерий.Исчерченными стрелками обозначены предполагаемые гомологи GadC.Ориентация стрелки обозначает направление транскрипции (транскрипция слидирующей цепи обозначена стрелкой, ориентированной вправо).Промежуточные гены обозначены белым цветом. Звёздочкой отмечены виды, укоторых обнаружено более одного гена, кодирующих глутаматдекарбоксилазу(De Biase et al., 2012).381.3.6 Функции ГАМК в кишечникеВ фундаментальных работах 1940-х годов Э. Гейл показал, что разные αдекарбоксилазы у E.coli обладают специфичностью к L-аминокислотам лизин,орнитин,аргинин,тирозин,глутаматигистидин,ииндуцируютсясоответствующими аминокислотами (Gale, 1940).

Другой индуктор αдекарбоксилаз - это низкий pH среды. Поэтому было сделано предположениемо потенциальном биологическом значении декарбоксилаз в качестве системыстабилизации внутренней среды клетки для её защиты от неблагоприятныхвнешних условий, в частности низкого pH. К этой проблеме вернулись в конце1990-х и глутамат- и аргинин-зависимые системы кислотоустойчивости былиобнаружены у видов E.coli, S.flexneri, L.monocytogenes и L. lactis (Lin et al.,1995; 1996; Sanders et al., 1998; Cotter et al., 2001; Hersh et al., 1996).

Такимобразом, была показана эффективная роль этих систем у несколько видовбактерий в их защите от кислотного стресса (E.coli, L.reuteri).Мы полагаем, что система gadBC встречающаяся у непатогенных бактерийможет играть иную роль (Siragusa et al., 2007; Li and Cao, 2010; Su et al., 2011).1.3.7 ГАМК-синтезирующие лактобациллы и бифидобактерии изкишечной микробиоты человека как векторы доставки ГАМК вкищечник.ГАМК-синтезирующиелактобациллыибифидобактерииможнорассматривать как способ доставки к нервным окончаниям блуждающего нерва(Dinan et al., 2015). Ряд фактов свидетельствует о влиянии ГАМК,синтезируемой бактериями кишечной микробиоты, на организм человека.1-В работе японских коллег изучили различия в уровне ГАМК в крови,просвете кишечника и в мозге между стерильными мышами и мышами,которые, будучи сначала стерильными, были заселены микробиотой обычныхмышей.

В результате количество ГАМК в крови и кишечнике было достоверновыше у последних мышей. При этом различий в количестве ГАМК в мозге двух39групп мышей не наблюдалось. Это подверждает тот факт, что ГАМКсинтезируется кишечной микробиотой и попадает в кровь; её проникновение вмозг строго контролируется гематоэнцефалическим бакрьером; предполагается,что влияние ГАМК на организм хозяина осуществляется иначе, например,через блуждающий нерв или энтеральную нервную систему (Matsumoto et al.,2013).2-Ещё один факт свидетельствует о ключевой роли блуждающего нерва: вработе (Bravo et al., 2011) сначала показали, что введение мышам штаммаL.rhamnosus JB-1 приводило к повышению количества ГАМКергическихрецепторов в мозге и к снижению тревожно- и депрессивноподобногоповедения по сравнению с контрольной группой мышей.

Затем повторили опытс ваготомизированными мышами, т.е. с мышами с иссечённым блуждающимнервом. В результате введение штамма L.rhamnosus JB-1 ваготомизированныммышам не имело никакого влияния ни на экспрессию ГАМК-рецепторов вмозге, ни на поведение.3-ВлитературеспособностьГАМК-продуцирующихштаммовснижатьсимптомы тревоги и депрессии у животных и людей подтверждается разнымиавторами (Ko et al., 2013; Stanton et al., 2013; Liu et al., 2016) и показана длявидов L.plantarum и L.brevis.Однако способность бактерий из кишечной микробиоты человекасинтезировать ГАМК была показана только в одной работе (Barrett et al., 2012)401.4 Катехоламины и серотонин1.4.1 Общая характеристика катехоламинов и серотонинаКатехоламины - это органические молекулы, содержащие группу катехола(бензольноеядросдвумягидроксильнымигруппами),связаннуюсаминногруппой.