Диссертация (Адаптивное значение для человека бактерий рода Lactobacillus и рода Bifidobacterium), страница 14

angulatum GT102gadBgadCГлутаматдекарбоксилазаПредполагаемыйГлутамат/ГАМКантипортерT4/MP127/L3478 акI264/MV31/IR171/H3M273/V469 акR314/KB. adolescentis 150gadBgadCГлутаматдекарбоксилазаПредполагаемыйГлутамат/ГАМКантипортер6Отсутствуют451 ак6Отсутствуют470 ак85Сравнительный анализ последовательностей аминокислот белков,участвующих в синтезе ГАМК, у L.plantarum 90sk, L.brevis 15f и B.angulatumGT102 и B.adolescentis 150 с последовательностями аминокислот у другихштаммов тех же видов из GenBank показал, что исследованные белкиштаммов L.plantarum 90sk, L.brevis 15f и B.angulatum GT102 содержат от 2-хдо 11 уникальных замен (см. приложение), что говорит об отличии штаммовРоссийской популяции от имеющихся в GenBank.

Что касается штаммаB.adolescentis 150, мы не нашли уникальных замен в исследованных белках.Результаты представлены в таблице 16 и в приложении.3.2.6 Изучение экспрессии гена глутаматдекарбоксилазы gad у штаммаL.plantarum 90sk.Представляло интерес изучить условия, влияющие на экспрессию gadгенов. Для этих опытов был выбран штамм L.plantarum 90sk.

Былаисследована экспрессия генов gadB и gadC на различных стадиях роста, приОтносительная экспрессияразличных pH среды и при добавлении в среду желчи.9876543210gadBgadC6 (нач. эксп.)12 (эксп.)24 (нач. стац.)Стадии роста культуры в часах48 (стац.)Рисунок 17. Относительная экспрессия генов gadB и gadC на различныхстадиях роста; (в качестве контрольного был использован ген recA).86ТранскрипционнаяактивностьгенаgadBначинаетрасти(приблизительно в 2 раза) в экспоненциальной фазе роста. Максимальныезначения экспрессии гена gadB достигнуты в начале стационарной фазы и в6-8 раз превосходили экспрессию у 6-часовой культуры.Ген gadB продолжал активно транскрибироваться и в стационарной фазероста.

(рис. 17)Относительная экспрессия гена gadC, кодирующего антипортер, быламаксимальной в стационарной фазе роста (двукратное увеличение).Зафиксировано небольшое, но достоверное увеличение относительнойэкспрессии гена gadC (в 1,5 раза) в стационарной фазе. Увеличенияэкспрессии в экспоненциальной фазе не было.Данные по экспрессии генов gadB и gadC у штамма L.plantarum 90skхорошо описываются кривой синтеза ГАМК.

На рисунке 17 видно, чтотранскрипционная активность гена gadB увеличивается уже через 12 часовкультивирования по отношению к ранней экспоненциальной фазе. При этомуровень экспрессии гена gadC сохраняется на том же уровне. Увеличениеэкспрессии гена gadB, вероятно, является следствием синтеза фермента denovo в ответ на появление субстрата (глутамат натрия) в питательной среде.Но для того, чтобы ГАМК накапливалась в среде, необходима активностьантипортера gadC, который переносит глутамат натрия в клетку, а ГАМК изклетки в среду. ГАМК, которую мы наблюдаем в точке 12 часов в среде,скорее всего является результатом базовой транскрипционной активностиантипортера gadC. Далее увеличение экспрессии гена gadB приводит кнакоплению внутри клетки ГАМК, что влечёт за собой индукцию экспрессиигена gadC и впоследствии выведение ГАМК из клетки наружу.

Всоответствие с данной схемой работы генов gadB и gadC, синтез ГАМКначинается после 12 часов роста и начинает накапливаться в средеэкспоненциально параллельно с индукцией транскрипционной активностигенов gadB и gadC. Из полученных данных можно сделать вывод о том, чтогены gadB и gadC не работают как оперонная система, что подверждается87расположением генов на хромосоме L.plantarum 90sk на значительномОтносительная экспрессиярасстоянии друг от друга.6gad5gadC43210контрольpH=3,5pH=5Различные условияMRS+0,1%желчиРисунок 18.

Влияние различных условий на экспрессию генов gadB и gadC встационарной фазе (24 часа) относительно гена recA.Выбранные условия обработки штамма в средах с низкими значениямирН и желчью не влияли на его жизнеспособность; жизнеспособность штаммане снижалась до рН 3,5 и резко падала при рН 2,5 (Табл. 17).Понижение pH среды до 3,5 и 5 в стационарной фазе роста культурыстимулировало экспрессию гена gadB относительно контроля в 3 и 3,5 разасоответственно; экспрессия гена gadC увеличивается в 3,5 и 3 раза. Влияния0,1% желчи на экспрессию генов gad и gadC не было.

Увеличение экспрессииобоих генов gadB и gadC как реакция на низкие значения pH говорит о том,что оба гена находятся под общей регуляцией.88Таблица 17. Влияние низких pH на жизнеспособность штамма L.plantarum90sk.Число КОЕУсловия2-хИсходноеПосле помещения в среду MRS счасовой индукцииколичество клетокнизким pH в иечение двух часовpH=2,51085,6.102pH=3,53.1074,2.1070,1% желчи1,2.1081,1.108Чтобыпреодолетькислуюсредужелудка,убактерийсформировались разные способы защиты (Bearson et al., 1997; Foster, 1999;Merrell and Camilli, 2002; Cotter and Hill, 2003).

Эти системы можноразделить на два типа: система ксилотоустойчивости (КУ) и системакислототолерантности (КТ). Для активации системы КТ в логарифмическойи стационарной фазах, перед тем, как подвергать клетку кислтотномустрессу (pH<3) требуется предварительное их пребывание в среде сумеренно кислым pH, в то время как система КУ позволяет клеткам встационарной фазе роста выжить при низких pH (<2,5) без предварительнойадаптации.Виды E.coli и S.flexneri имеют аргинин- и глутамат-зависимыесистемы КУ (Lin et al., 1995; 1996).

Глутамат-зависисмая система КУявляется наиболее эффективной и её роль в защите бактерий от низких pHдоказана также для видов L.monocytogenes, Lactocossus lactis и L.reuteri(Sanders et al., 1998; Cotter et al., 2001, Su et al., 2011). Для работы этойсистемы нужны ферменты GAD и глютамат/ГАМК антипортер (Hersh et al.,1996; Waterman and Small, 1996).Подробнее эта система описана влитературном обзоре. Для L.plantarum установлена зависимость междукаталитической активностью фермента GAD и низким pH.

В работе (Shin etal., 2014) было показано, что устойчивость к низким pH связана с С-концомGAD-белка.89Данный раздел работы был выполнен в Институте морфологии человекаРАМН совместно с Ю.Е. Козловским.3.2.7 Определение влияния штамма L.plantarum 90sk на крыс в условияххолодового холода.Для проверки предполагаемого эффекта ГАМК-продуцирующего штаммаL.plantarum 90sk на животных, были проведены опыты на крысах линии СпрэгДоули, подвергнутых холодовому шоку; в качестве штамма сравнения былвыбран пробиотический штамм L.rhamnosus GG (Doron et al., 2005),неспособный к синтезу ГАМК. Штамм L.plantarum 90sk был выбран потому,что помимо синтеза ГАМК, он обладал оптимальными пробиотическимисвойствами (антиоксидантными свойствами, антагонистической активностьюпо отношению к патогенным и условно-патогенным штаммам, устойчивостью книзким pH).

Схема опыта представлена на рис. 19.90Рисунок 19. Схема опыта по определению влияния штамма L.plantarum 90sk накрыс в условиях холодового шока.ГАМК 2,5мкМ/Л21,510,50MRSL.rhamnosus GG L.plantarum 90skРисунок 20. Количество ГАМК в крови крыс Спрэг-Доули по окончании опыта.91Уровень ГАМК в крови крыс, получавших ГАМК-продуцирующий штамм,был достоверно выше по сравнению с двумя контрольными группами (MRS иL.rhamnosus GG) (рис. 20).Пролактиннг/мл1815129630MRSL.rhamnosus GGL.plantarum 90skРисунок 21. Количество пролактина в крови крыс Спрэг-Доули по окончанииопыта.Количество гормона стресса пролактина в крови крыс, получавших штаммL.plantarum 90sk, было достоверно ниже, чем у крыс получавших стерильнуюсреду MRS и штамм L.rhamnosus GG (рис.21).Увеличение содержания ГАМК в крови крыс опытной группысвидетельствует о том, что ГАМК, синтезируемая в кишечнике животныхштаммом L.plantarum 90sk, затем попадала в кровяное русло.

Снижениеуровня пролактина в крови крыс опытной группы подтверждает тот факт, чтопотребление животными данного бактериального штамма способствовало ихнекоторой адаптации к стрессу.Действие штаммов-психобитоиков на нервную систему животных илюдей выражается в облегчении депрессивного состояния и встревоженности уних. Влияние лактобактерий на поведение и состояние животных и людейосновано на физиологических изменениях в организме: активация ГАМКрецепторов, снижение уровня гормонов стресса в крови и другие показатели.Механизмы, обусловливающие эти изменения не до конца выяснены иочевидно их много.

Способность к синтезу ГАМК является потенциальным92пробиотическимсвойствомобусловливающемэтиизменения.Естьдоказательства, что штаммы лактобацилл и бифидобактерий способнысинтезировать ГАМК в кишечнике in situ (Li et al., 2010). Действие ГАМКможет быть опосредованным энтеральной нервной системой в частностиблуждающим нервом (Bravo et al., 2011).933.3 Изучение влияния катехоламинов и серотонина на рост итранскрипционную активность лактобацилл и бифидобактерий.3.3.1 Оптимизация условий опытов по влиянию нейротрансмиттеров нарост лактобацилл и бифидобактерий.Для исследования влияния на лактобацилл и бифидобактерий быливыбраны 3 нейротрансмиттера, относящихся к семейству катехоламинов(норадреналин, адреналин и дофамин), продукция которых организмомчеловека значительно увеличивается в стрессовых условиях.