Диссертация (Роль функциональных показателей сперматозоидов отца в программах предимплантационного генетического скрининга эмбрионов), страница 2

Кулакова» МинистерстваздравоохраненияРоссийскойФедерации,ЛабораторияВРТотделениявосстановления и лечения репродуктивной функции (руководитель – к.м.н.Абубакиров А.Н.), Отделение молекулярно-генетических методов (руководитель– д.б.н. Трофимов Д.Ю.).Научная новизна работыАнализ научной литературы показал, что подобные комплексныеисследования, включающие в себя сравнение характеристик сперматозоидовотцасрезультатамиполногеномногоскринингаэмбрионов,ранеенепроводились.

Представленная работа весьма актуальна для отечественной науки,так как протоколы тактики лечения бесплодных пар в настоящее времядополняются и пересматриваются.Анализ фрагментации ДНК ядра сперматозоидов – относительно новыйметодврутиннойпрактикеобследованияпациентоввпрограммахвспомогательных репродуктивных технологий, в связи с чем влияние данногопараметра на генетический материал эмбриона требует тщательного изучения.

Врамках настоящего исследования установлено, что уровень фрагментации ДНКвыше 15% ассоциирован с делециями и дупликациями в хромосомах эмбрионов,а также сопровождается увеличением вероятности рождения ребенка ссиндромом Шерешевского-Тернера.Теоретическая и практическая значимостьРождение здорового ребенка в семье – важная социальная и экономическаязадача государства, поэтому поиск возможностей для решения данной задачиотносится к числу приоритетных направлений науки и медицины.Настоящее исследование расширяет имеющиеся представления о влияниифункциональных показателей сперматозоидов отца на генетический материалэмбриона.7Результаты,полученныеврамкахпредставленнойработы,будутспособствовать оптимизации схемы лабораторного обследования мужчин ивыборудополнительныхпоказанийдляпрохожденияпрограммпредимплантационного генетического скрининга.Методология и методы диссертационного исследованияОпределениеконцентрации,подвижностииморфологическиххарактеристик сперматозоидов проводилось с использованием автоматическогоспермоанализатора ВиодеоТест 2.1 (Россия).

Уровень фрагментации ДНКсперматозоидов устанавливался методом TUNEL. Для всех пар было проведеноэкстракорпоральное оплодотворение методом ИКСИ с последующей биопсиейэмбрионов.Биопсированныйгенетическийматериалбылподвергнутпредимплантационному генетическому скринингу с помощью сравнительнойгеномной гибридизации на чипах. Статистическая обработка результатовпроводилась с использованием программ «Statistica 6.0» и «R language» (R CoreTeam, 2015).Положения, выносимые на защиту1. Функциональные показатели сперматозоидов отца оказывают значимоевлияниенарезультатыпредимплантационногогенетическогоскринингаэмбрионов, полученных методом ИКСИ.2. Уменьшение содержания морфологически нормальных сперматозоидов доуровня ниже 4% приводит к увеличению частоты эмбрионов с численнымианомалиями хромосом, а также делециями и дупликациями.

Снижениеконцентрации сперматозоидов (менее 15 млн/мл) сопровождается повышениемвстречаемости эмбрионов с кариотипом 45, Х0. Вместе с тем подвижностьсперматозоидов не влияет на результаты ПГС при проведении оплодотворенияметодом ИКСИ.3. Уровень фрагментации ДНК выше 15% ассоциирован с делециями идупликациями в хромосомах эмбрионов, а также с увеличением частотыкариотипа 45, Х0.84. Проведение предимплантационного генетического скрининга эмбрионовпри выявлении у мужчин патологии сперматозоидов позволит снизить как рискрождения ребенка с заболеваниями, обусловленными изменением числа иструктуры хромосом, так ивероятность невынашивания беременности исамопроизвольного абортирования плода, связанных с наличием аномалий вкариотипе эмбриона.Степень достоверностиДостоверность результатов исследования подтверждается достаточнымобъемом фактического материала (147 пар, 761 исследованный эмбрион),применением современных технологий и использованием методов статистическойобработки данных, полностью соответствующих поставленным задачам.Апробация результатов диссертацииМатериалы диссертации доложены в виде постерных докладов на 13-оймеждународной конференции РАРЧ «Репродуктивные технологии сегодня изавтра» (г.

Волгоград, 2013 г.), на 32-ой Европейской конференции обществарепродуктологов и эмбриологов (The 32th ESHRE, Финляндия, 2016 г.), на 15-ойинтернациональнойконференциипопредимплантационнойдиагностике(PGDIS, Италия, 2016 г.) и заседании кафедры биологии и общей генетикимедицинского института РУДН (2017 г.).Внедрение результатов в практикуРекомендациидляпервичногообследованияэякулятамужчиннадополнительные параметры внедрены в практику ФГБУ «Научный центракушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова»Министерства здравоохранения России. Анализ фрагментации ДНК ядрасперматозоидовдобавленв рекомендуемыйсписокобследованийпередвступлением пары в программу ЭКО/ИКСИ в Отделении Репродукции ФГБУ«Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И.Кулакова» Министерства здравоохранения России.9ГЛАВА 1ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ1.1.Функциональные показатели сперматозоидов.

Причины мужскогобесплодияМужскоебесплодиеявляетсямультифакториальнойпатологией,охватывающей широкое разнообразие расстройств. Оно может быть врожденнымили приобретенным, причем в более чем половине случаев его причинанеизвестна.Бесплодие у мужчин может быть диагностировано путем анализа спермы.Порезультатамспермограммывыявляетсярядфункциональноважныхпараметров, чьи нормальные показатели определяются по рекомендациям ВОЗ и стечением времени уточняются [WHO 2001, 2010]:1) концентрация сперматозоидов в эякуляте (в случае недостаточнойконцентрации ставится диагноз олигозооспермия, при полном отсутствиисперматозоидов – азооспермия);2) подвижность сперматозоидов в эякуляте (при недостаточной подвижностиставится диагноз астенозооспермия);3) морфология сперматозоидов согласно критериям Крюгера (в случаевысокого содержания морфологически аномальных сперматозоидов ставитсядиагноз тератозооспермия).Следует отметить, что рекомендации ВОЗ постепенно меняются, и критерии«нормы» становятся менее строгими.

Так, если в 2002 г. норма концентрациисперматозоидов в миллилитре эякулята составляла 20 млн., то в 2010 г. данныйпоказатель составляет уже 15 млн. сперматозоидов на миллилитр [WHO 2001,2010].По подвижности сперматозоиды разделяют на 4 категории: A,B,C и D.К категории «А» относятся сперматозоиды, которые движутся прямолинейносо скоростью не менее 25 мкм/сек.10В категории «B» - сперматозоиды, перемещающиеся прямолинейно соскоростью менее 25 мкм/сек.Вкатегории«С»сперматозоиды,-которыедвижутсяслабо,непрямолинейно или колеблются.Категорию «D» составляют неподвижные сперматозоиды.Считается, что яйцеклетку достигают сперматозоиды категорий A и B.

Дляопределениясодержаниясперматозоидовразныхкатегорийподвижностииспользуется спермоанализатор. По предложению ВОЗ эякулят считаетсянормальным, если выполняется одно из двух условий или оба условия: 1) долясперматозоидовкатегорииподвижностиAнеменьше15 %;2)долясперматозоидов категорий подвижности A и B в сумме не меньше 32%.Разные специалисты оценивали морфологию сперматозоидов по-разному,пока в 1986 г.

Т. Крюгер и Р. Менквельт не предложили строгие критерии,основанные на морфологии посткоитальных сперматозоидов. Они изучали толькоте сперматозоиды, которые смогли пройти через нити цервикальной слизи. Былосделано предположение, что такие клетки являются более фертильными, нежелиимеющиеморфологическиедефекты.Впоследствииуказанныйтипсперматозоидов стали использовать в качестве эталона для сравнения, что легло воснову концепции строгих критериев. Данное предположение было доказанорезультатами, полученными при изучении морфологических характеристиксперматозоидов, связанных с зоной пеллюцида яйцеклетки в условиях in vitro[Kruger T.F., 1996; Liu D.Y.et al., 1992].Можно предположить, что измененная морфология сперматозоидовпрепятствует правильному слиянию цитоплазмы яйцеклетки и сперматозоидалибо ведет к рецепторной дисфункции.

Однако в таком случае мужское бесплодиелегко преодолевалось бы оплодотворением методом ИКСИ. Однако, несмотря наиспользование данного метода оплодотворения, получение жизнеспособногоэмбриона и наступление беременности затруднено в парах со сниженной долейморфологически нормальных сперматозоидов. Возможно, причиной являютсянарушенияворганизациихромосомногоматериалавморфологически11«неправильном» сперматозоиде, что может не только препятствовать слияниюсперматозоида и яйцеклетки, но и отрицательно влиять на развитие эмбриона. Влитературе существуют указания на корреляцию между нарушениями ворганизации ядер у морфологически аномальных сперматозоидов и ихспособностью к оплодотворению [Воробьева О.А., 2005].Установлено, что мужской геном экспрессируется у эмбрионов человека ужена стадии 4-8 бластомеров.

На этой стадии развития эмбрион начинаетразвиваться согласно программе диплоидного генома, и постепенно проявляютсяаномалии развития, обусловленные нарушениями в кариотипе сперматозоида[Баранов В.С.,2007].Согласно приведенной концепции, необходим строгий отбор сперматозоидовдля оплодотворения по морфологическим показателям.

Такая методика ужеразвита в мировой клинической практике, и получила название ИМСИ(усовершенствованнаятщательнотехнологияотобранногоИКСИ,морфологическиоснованнаянормальногонамикроинъекциисперматозоидавцитоплазму яйцеклетки). По литературным данным, использование метода ИМСИснижает частоту анеуплоидий по половых хромосомам. Данная технологиясвязана со значительно меньшим риском получения эмбрионов с хаотичнымнабором хромосом, что ведет к уменьшению числа отмен переносов в циклах ВРТ[Setti A.S.