Диссертация (Роль функциональных показателей сперматозоидов отца в программах предимплантационного генетического скрининга эмбрионов), страница 10

Снять надосадочную фракцию всплывших сперматозоидов.II.4. Оценить объем суспензии, подсчитать количество и подвижность клеток вкамере Маклера. Если нужно увеличить концентрацию, центрифугировать 5 минпри 300 g, затем удалить часть надосадочной жидкости и снова определитьконцентрацию.Материалы и среды:1. Среда с гиалуронидазой Sydney IVF Hyaluronidase 5x1,2. Среда с поливинилпиролидоном (PVP) Sydney IVF, PVP 5X200 мкл, 3. Средадля отмывки ооцитов Sydney IVF oocyte wash buffer 100 ml,4. OVOIL - парафиновое масло, Virtolife.5. Чашка Петри (21,5см х 2,60 х15 мм) газопроницаемая.6. Микропипетки.Предварительная подготовка1.

Приготовление чашки для ИКСИ за 1 час до процедуры. В крышку от чашкиПетри диаметром 60 мм раскапывается среда для гамет (промывочные капли идве капли для инъекций) и среда для иммобилизации сперматозоидов (двебольшие капли и одна микрокапля), капли заливаются 7,5 мл минерального масла.Количество чашек для ИКСИ определяется количеством ооцитов (до 6 ооцитов - 1чашка, более 6 ооцитов - 2 чашки).2.

Непосредственно перед процедурой в микроманипуляторы устанавливаютсямикроинструменты: присоска для удержания ооцита и игла для обездвиживания иинъекции сперматозоида. Концы микроинструментов устанавливаются в фокусе вцентре поля зрения, на одной линии, параллельно оператору. Срез микроприсоскидолжен быть перпендикулярен микрошприцу.503. Утром дня пункции готовится 4-х луночный планшет (в лунках средадробления, в центральной лунке - промывочная среда).Процедура ИКСИ1.В большую каплю со средой для иммобилизации сперматозоидов подбинокуляром помещается минимальное количество суспензии сперматозоидов.2.На предметный столик микроскопа с установленными манипуляторамиустанавливают чашку для ИКСИ таким образом, чтобы капли для инъекцийнаходились на подогреваемой поверхности, в поле зрения попадали только каплисо средой для иммобилизации сперматозоидов.

В микрокаплю со средой дляиммобилизациисперматозоидовврабочееположениеустанавливаютмикрошприц и промывают несколько раз. Микроприсоска остается в верхнемположении.3.Подмаксимальнымувеличениемвыбираютактивноподвижныесперматозоиды с нормальной морфологией, затем пересаживают выбранныесперматозоиды из большой капли в микрокаплю.4.Отбор необходимого количества сперматозоидов производится поочередново всех чашках для ИКСИ. После отбора чашку помещают на нагревательныйстол в ламинарный бокс.5.Зрелые ооциты из лунки № 2 или № 3 планшета для пункции (максимум триштуки) промывают в каплях со средой для гамет, после чего помещают в каплюдля инъекций.6.На предметный столик микроскопа с манипуляторами устанавливают чашкудля ИКСИ как в п.2.7.Сперматозоид из микрокапли со средой для иммобилизации обездвиживаютпутем двойного перерубания хвоста, после чего набирают сперматозоид вмикрошприц, начиная с хвоста.8.Чашку для ИКСИ передвигают по предметному столику таким образом,чтобы крайняя капля для промывки, соседняя с ооцитами, оказалась в полезрения.51Микроприсоску опускают в рабочее нижнее положение и промывают9.средой.

С помощью препаратоводителя в поле зрения помещается капля сооцитами.Ооцит присасывают микроприсоской таким образом, чтобы полярное10.тельце находилось на 12 или 6 часов. Конец микрошприца устанавливают на 3часа.11.Сперматозоид подгоняют к концу микрошприца, после чего прокалываютзону пелюцида и ооцит до середины объема.12.Аспирируют цитоплазму ооцита до характерного разрыва оолеммы.13.Выпускают в центр ооцита сперматозоид и выходят из клетки.14.Перемещают ооцит к верхнему или нижнему краю капли.15.Инъецируют все ооциты, повторяя п. 6-14.16.Чашку для ИКСИ помещают на нагревательный стол в ламинарный бокс.Инъецированные ооциты промывают в первой лунке 4-х луночного планшета сосредой для дробления и оставляют в остальных лунках, а чашку убирают винкубатор.17.Оплодотворяют все ооциты пациентки, повторяя п.

5-16, чередуя чашки дляИКСИ.Расходные материалы для процедуры ИКСИ UniversalIVFmedium(Origioилианалогичнаясредадругогопроизводителя) BlasAssist (BA, среда для выращивания бластоцист), ISM2 (Origio, среда длядробления эмбрионов) Flushing medium (Origio или аналогичная среда другого производителя,промывочная среда) Культуральное масло, CultureOil (LiquidParaffinOil, Origio; Ovoil, Virtolife;MineralOil, Cook или FertiOil, FertiPro) – применяется в зависимости от типапроцедуры и сред для культивирования.52Денудация (декоронизация) яйцеклеток для ИКСИДенудацию ооцитов начинают по истечению, по крайней мере, 1-2 часовпосле трансвагинальной пункции (ТВП). Процедуру проводят в чашке дляинъекции.ИКСИ выполняют спустя не менее 30 мин после денудации ооцитов.После инъекции ооциты переносят в чашки ―инсеминации‖ или культивированиядо проверки оплодотворения на 1-й день.Оценка оплодотворения (1-й день)Оплодотворение оценивают спустя 16-20 часов после инсеминированияиспользуя инвертированный микроскоп.

После ИКСИ инжектированные ооцитыпереносят в чашки культивирования в капли под маслом, оценивают ихоплодотворение и оставляют там для дальнейшего дробления.Оценка раннего дробленияРаннее дробление оценивают спустя 25-26 часов после оплодотворения IVFили 24-25 часов после ИКСИ.Оценка и отбор эмбрионов для переноса (ET от англ. Embryo transfer) икриоконсервации (2-й день)Оценивают качество эмбрионов и выбирают эмбрионы для ET.

Эмбрионы свысокой фрагментацией и мультинуклеированные эмбрионы (более чем в одномбластомере) на 2-й день исключаются из культивирования. Если планируетсязамораживаниеэмбрионовнаэтойстадии,отбираютэмбрионыдлякриоконсервации и отмечают это в эмбриологическом протоколе.Чашки для переноса готовят за день до предполагаемого переноса.После селекции эмбрионы переносят в чашку для ET. Вначале эмбрионыпереставляют в наружную лунку чашки. Затем сменяют наконечник пипетки ичистым наконечником переносят эмбрион в центральную лунку чашки для ET.53После оценки эмбрионов готовят чашку для культивирования до стадиибластоцист. Готовят культуральную чашку с 0,5 мл BA в центральной лунке.Если остается только 1-2 эмбриона для дальнейшего культивирования, ихможно выращивать в каплях: 30 мкл BA или аналогичной среды.

Чашки готовятна 2-5 день культивирования. Чашка содержит максимум 5-6 капель дляэмбрионов и две дополнительных капли для промывки инструмента при переносеэмбриона.Эмбрионы затем перемещают в чашки со средой для бластоцист.Оценка и отбор эмбрионов для ET и криоконсервации (3-й день)Оценивают качество эмбрионов и выбирают эмбрионы для ET и длякриоконсервации.Эмбрионы с высокой фрагментацией и мультинуклеацией исключаются.Перемещают эмбрионы в чашки со средой для бластоцист (если культивированиене было начато со второго дня).Оценка и отбор эмбрионов для ET и криоконсервации (4-й день)Оценивают качество эмбрионов и выбирают эмбрионы для ET икриоконсервации по протоколу витрификации, если наблюдается полнаякомпактизация морул, и нет возможности замораживать на 5-й день. Если ETпланируется на 5-й день, готовят чашки для ET с холодной средой BA.Оценка и отбор эмбрионов для ET и криоконсервации (5-й день)Эмбрионы оцениваются, и если ET планируется на 5-й день, то выбираютбластоцисты высшего качества (top quality).

Замораживание осуществляетсяметодом витрификации.На сегодняшний день криоконсервация эмбрионов является важнымкомпонентомпрограммВРТ.Согласнопроведеннымисследованиям,использование размороженных эмбрионов, криоконсервированных методоммедленногозамораживанияилиметодомвитрификации,неоказывает54неблагоприятного воздействия на акушерские и перинатальные исходы всравнении с нативными циклами [Кравчук Я.Н., Калугина А.С., 2013].Ряд исследователей показали, что на ранних стадиях развития поморфологическим критериям невозможно отличить анеуплоидные эмбрионы отнормальных [Fragouli E. et al., 2014].

Для наглядной демонстрации сходства ихморфологическихдиагностированнойхарактеристикпатологиейприводимпослефотографиипроведенногоПГСэмбрионовиспризнанныхнормальными. (Рис.5, 6) .Рис. 5. Бластоциста 5-х суток развития, категории 5AA, по генетическойэкспертизе: 48, XY (+15,+21) – двойная трисомия.

[Фотоархив ОтделенияРепродукции ФГБУ НЦ «АГиП им. В.И. Кулакова МинЗдрава России].55Рис. 6. Бластоциста 5-х суток развития, категории 5AA, по генетическойэкспертизе: 46, XX – норма [Фотоархив Отделения Репродукции ФГБУ НЦ«АГиП им. В.И. Кулакова МинЗдрава России].Принятая оценка бластоцист (категория) основана на классификации Д.Гарднера [Schoolcraft WB et al.,1999,Gardner DK, Balaban B., 2006]. В этой системекаждой бластоцисте дают три независимые оценки: Цифру, обозначающую стадию развития1. Ранняя бластоциста – бластоциста, в которой полость занимает менееполовины объема эмбриона.2. Бластоциста, или средняя бластоциста – полость занимает болееполовины объема эмбриона.3. Полная бластоциста – полость занимает практически весь объемэмбриона, но сам эмбрион еще не начал «раздуваться».564.

Поздняя, или экспандированная бластоциста – полость продолжаетрасти, растягивая весь эмбрион, и теперь превышает его исходный размер. Самабластоциста «раздувается», а ее оболочка (zona pellucida) растягивается истановится тоньше.5. Хэтчинговая бластоциста – бластоциста, начавшая «вылупляться» изzona pellucida.6. Бластоциста вылупившаяся. Букву, обозначающую качество ВКМ – внутренней клеточной массы(«комка» клеток внутри бластоцисты, из которого в будущем образуетсясобственно плод и некоторые внезародышевые ткани).А – отлично – много клеток, они компактно уложены.B – хорошо – клеток меньше или они уложены менее компактно.C – плохо – мало клеток, уложены некомпактно. Букву, обозначающую качество ТЭ – трофоэктодермы («пузыря»клеток вокруг полости бластоцисты, из которых в будущем образуетсяэмбриональная часть плаценты).A – отлично – много клеток, образующих «хороший» эпителиальныйпласт.B – хорошо – клеток меньше, эпителий «хуже».C – плохо – очень мало клеток.Оценка и отбор эмбрионов для криоконсервации и ET и биопсии на 6-й деньразвитияВ исключительных случаях, если замораживание не производилось ранее,бластоцисты хорошего качества могут быть заморожены методом витрификациина 6-й день.572.2.5.