Диссертация (Роль функциональных показателей сперматозоидов отца в программах предимплантационного генетического скрининга эмбрионов), страница 8

Триггер овуляциивводили при наличии в яичниках ≥3 фолликулов диаметром ≥ 17 мм.Трансвагинальная пункция яичников (ТВП) выполнялась через35-36часовпосле введения триггера овуляции.382.2.Методы исследованияПрипроведенииспособствующиеданногоуспешномуисследованиядостижениюиспользовалисьпоставленныхвнихметоды,целей.Применялись как традиционные методы, уже давно внедренные в клиническуюпрактику (анализ функциональные показателей, метод ИКСИ, биопсия икриоконсервация), так и сравнительно недавно разработанные и еще неполучившие повсеместного распространения (анализ фрагментации ДНК ядрасперматозоидов, СГГ на чипах).Известно, что разработка и внедрение в практику конкретных методовисследованиянепосредственносвязанысиспользованиемопределенногооборудования, реактивов и материалов.

Результат исследования, как правило,напрямую связан с определенной последовательностью проводимых операций иточнымсоблюдениемтеоретическиобоснованноговременногографика.Приводимые в работе методики тех или иных процедур явились результатоммноголетних наработок, апробации различных подходов к оптимизации процессаи улучшению качества проводимых процедур.

Многие протоколы былиразработаны с непосредственным участием автора исследования. В этой связинами уделено значительно внимание подробному описанию методик, что можетбыть полезным для практикующих врачей и эмбриологов.2.2.1. Определениеконцентрации,подвижностииморфологиисперматозоидовКонцентрация, подвижность и морфология сперматозоидов – важнейшиефункциональные показатели, указывающие на возможность или невозможностьоплодотворения яйцеклетки и отражающиеся на генетическом материалеполучаемыхэмбрионов.Подсчетиопределениеданныхпараметровпроизводились следующим образом:1.измерение объема эякулята;392.оценка консистенции (вязкость оценивается по длине нити, извлекаемой изэякулята с помощью стеклянной палочки.

Критерий нормы: длина нити не более 2см);3.оценка внешнего вида эякулята (коричневый оттенок - при гемоспермии,при пиоспермии - зеленоватый, при олиго-азооспермии - цвет прозрачный;наличие хлопьев, взвеси, осадка расценивается как патология и фиксируется врезультатах);4.для подготовки образца для исследования морфологии на предметноестекло наконечником пипетки наносится 2 полоски по 3 мкл и ребром пипеткираспределяется по стеклу;5.для точного измерения концентрации сперматозоидов добавляется 50 мклэякулята к 50 мкл гипертонического раствора (обездвиживание сперматозоидов);6.6 мкл полученной суспензии наносится в центр камеры Маклера ипроводится подсчет концентрации;7.6 мкл эякулята наносится в центр другой камеры Маклера и далееоценивается подвижность сперматозоидов с использованием спермоанализатора(во избежание снижения или увеличения температуры и высыхания препаратаоценка подвижности производится немедленно после приготовления препарата);8.измерение рН образца;9.в том случае, если в эякуляте присутствует значительное количествокруглых клеток (> 1 млн/мл), необходимо провести тест LeucoScreen для оценкиколичества клеток сперматогенеза и лейкоцитов в эякуляте;10.окрашивание образца для оценки морфологии;11.если сперматозоиды в образце отсутствуют, то эякулят центрифугируетсяпри 1500 об/мин в течение 10 минут, после чего осадок исследуется снова; еслисперматозоиды найдены, то оценивается их среднее количество в поле зрения иих подвижность;12.приотсутствиисперматозоидоввосадкевыноситсязаключение«азооспермия»; в этом случае необходимо в осадке произвести поиск клетоксперматогенеза и результат поиска отметить в бланке результата;4013.оценкаагглютинациииагрегациисперматозоидов(агглютинацияпредставляет собой процесс склеивания сперматозоидов, чаще живых, междусобой без других клеток; если включаются другие клетки, дебрис и неподвижныесперматозоиды, то склеивание вызвано агрегацией; малые агрегаты из мертвыхсперматозоидов и другого материала могут быть в нормальной сперме,присутствие больших агрегатов, содержащих сотни сперматозоидов, являетсяпатологичным);Определениеконцентрации,подвижностииморфологическиххарактеристик сперматозоидов в рамках представленной работы проводилось сиспользованием автоматического спермоанализатора ВиодеоТест 2.1 (Россия).

Вкачестве нормы рассматривались следующие параметры: концентрация – более 15млн/мл, доля активно подвижных сперматозоидов– более 32%, долясперматозоидов с нормальной морфологией – более 4%.2.2.2. Метод определенияфрагментации ДНК ядра сперматозоидов(метод TUNEL)ЦельюисследованиясперматозоидовметодомTUNELявляетсяокрашивание ядер сперматозоидов для выявления повреждений, фрагментацииДНК, оценки жизнеспособности сперматозоидов и их фертильной функции.Данный метод по литературным данным признается самым эффективным,достоверным и с максимально сниженным влиянием человеческого фактора.Метод TUNEL [terminal deoxynucleotidyl transferases (TdT) dUTP endlabeling] используется для прямого мечения разрывов ДНК по свободным ОНконцам.

Интенсивность флуоресценции пропорциональна числу разрывов в ДНК.Метод основан на встраивании флуоресцирующего меченого нуклеотида спомощьюэнзиматическойсперматозоидов.реакциивместафрагментацииДНКядерВ результатах рассчитывается процент TUNEL-позитивныхклеток в препарате у данного пациента. По литературным данным пациенты, укоторых обнаруживают более 15% TUNEL-позитивных сперматозоидов, имеютсниженную результативность ЭКО.41Анализ фрагментации ДНК сперматозоидов может помочь в постановкедиагноза и выборе правильного метода лечения мужского бесплодия.ПрипроведенииметодаTUNELиспользовалсянаборреактивовАpopTagInSituApoptosisDetectionKits фирмы МILLIPORE.Компоненты, входящие в набор:1.

Еquilibration Buffer;2. Reaction Buffer;3. TdT Enzyme (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated);4. Stop/Wash Buffer;5. Blocring Solution;6. Anty-Dioxigenin Conjugate - содержит флуоресцентный краситель.Дополнительные реактивы:1.1% раствор параформальдегида в фосфатном буфере;2.Фосфатный буфер;3.Ядерный флуоресцентный краситель DAPI (0,5mg/ml) (4,6 Диамидино 2фенилиндол дигидрохлорид).Материалы:1.Предметные стекла, покровные стекла;2.Автоматические пипетки на 100 мкл и 10 мкл, наконечники кавтоматическим пипеткам;3.Пробирки стерильные типа эппендорф (1 мл) или центрифужные (14 -15мл);4.Чашки Петри (90 мм).Оборудование для проведения исследования:1.Флуоресцентный микроскоп (x 200 - 400);2.Термостат;3.Вытяжной шкаф;4.Морозильная камера.42Последовательностьдействийприпроведениипроцедуры:1.

Порция сданного эякулята разжижается до однородной консистенции (не более30 минут).Одновременно с анализом фрагментации ДНК из данной порции эякулятавыполняется анализ спермограммы. Оцениваются концентрация и подвижностьсперматозоидов в камере Маклера.2. Отмываются сперматозоиды от спермальной жидкости в Sperm.Prep.medium(соотношение 1:1).3. Центрифугирование 10 мин при 300 g.4. Снимается надосадочная жидкость, осадок суспензируется в зависимости отвеличины осадка в 200-500 мкл Sperm.Prep.

medium.5. Оценивается концентрация сперматозоидов в камере Маклера. Затем образец6разводится до концентрации 1х10 клеток в 1 мл.6. На предметное стекло с полилизиновым покрытием наносится препаратсперматозоидов отмытых от спермальной жидкости в количестве 5 мкл и6концентрации 1 х10 мл.7.Препарат высушивается.8.Выполняетсяфиксациявтечение10минутв1%растворепараформальдегида в фосфатном буфере.9.Промывка в фосфатном буфере 2 раза по 5 минут.10.Препарат помещается в смесь этанола с уксусной кислотой (2:1) на 5 минутпри -20о С.11.Промывка в фосфатном буфере 2 раза по 5 минут.12.На препарат наносится капля EQUILIBRATION BUFFER иинкубируется 10 секунд.

Удаляется жидкость с препарата.13.На препарат наносится капля(14 мкл) приготовленного раствораTdTENZYME (77 мл REACTION BUFFER + 33 мл TdT ENZYME) и инкубируется 60мин при 37о С.4314.На препарат наносится приготовленный раствор STOP/WASH BUFFER:Н2О(1:34) на 10 минут. Промывается препарат в фосфатном буфере 2 раза по 1минуте.15.На препарат наносится капля (14 мкл) приготовленного раствора ANTY-DIGOXIGENIN CONJUGATEDIGOXIGENIN(68 мл BLOCKING SOLUTION + 62 млCONJUGATE)содержащегофлуоресцентныйANTY-краситель(rhodamine) и инкубируется 30 минут.16.Промывка в фосфатном буфере 2 раза по 5 минут.17.На препарат наносится раствор ядерного флуоресцентного красителя DAPI(0,5 мг/мл) на 5 минут.18.Препарат промывается в фосфатном буфере 4 раза по 5 минут.19.На него наносится Fluoromount Aqueous Mounting (флюоромонд водныйраствор (Sigma)) и покрывается покровным стеклом. Данный этап применяетсядля усиления эффекта флюоресценции.Анализ результатов исследованияПрепараты анализируются с использованием флуоресцентного микроскопас двумя разными фильтрами (350 нм и 560 нм).Необходимо просмотреть препарат в нескольких полях зрения и оценить 1000клеток.