Диссертация (Роль функциональных показателей сперматозоидов отца в программах предимплантационного генетического скрининга эмбрионов)

Федеральное государственное автономное образовательное учреждениевысшего образованияРОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВНа правах рукописиКиселева Юлия ЮрьевнаРОЛЬ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СПЕРМАТОЗОИДОВОТЦА В ПРОГРАММАХ ПРЕДИМПЛАНТАЦИОННОГОГЕНЕТИЧЕСКОГО СКРИНИНГА ЭМБРИОНОВ03.02.07 – генетикаДИССЕРТАЦИЯна соискание ученой степени кандидата биологических наукНаучный руководитель:Азова Мадина Мухамедовна – доктор биологических наук, доцентМосква2017ОГЛАВЛЕНИЕСтр.Введение…………………………………………………………………..3Глава 1.

Обзор литературы…………………………………………….101.1Функциональные показатели сперматозоидов. Причинымужского бесплодия……............................................................................101.2Фрагментация ДНК ядра сперматозоидов……………………231.3Предимплантационный генетический скрининг эмбрионов…30Глава 2. Материал и методы исследования………………………….382.1.Материал исследования ……………………………………………382.2.Методы исследования ………………………………………………39Глава 3. Результаты и обсуждение……………………………………...643.1.Концентрация сперматозоидов……………………………………..643.2.Подвижность сперматозоидов……………………………………...693.3.Морфология сперматозоидов ………………………………………723.4.Фрагментация ДНК ядра сперматозоидов ………………………..803.5.Распределение эмбрионов по полу в зависимости от параметровспермограммы……………………………………………………………….83Заключение…………………………………………………………………87Список сокращений……………………………………………………….89Список литературы……………………………………………………….902ВВЕДЕНИЕРабота выполнена на базе Федерального государственного бюджетногоучреждения «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имениакадемика В.И.

Кулакова» Министерства здравоохранения России и на кафедребиологиииобщейгосударственногогенетикиавтономногоМедицинскогоинститутаобразовательногоФедеральногоучреждениявысшегообразования «Российский университет дружбы народов».Актуальность проблемыВ течение многих лет бесплодие остается актуальной медико-социальнойпроблемой. Известно, что с ней в течение репродуктивного периода сталкиваютсяот 8% до 15% супружеских пар (ВОЗ, 2010), то есть в мире насчитывается более100 млн. супружеских пар, не способных к самостоятельному зачатию ребенка,причем более 40% из них не могут иметь детей по причине мужского бесплодия.Лишь у 70% мужчин удается установить причину бесплодия современнымиметодами диагностики, а остальные 30% случаев приходятся на так называемоеидиопатическое бесплодие [Krausz C., Forti G., 2012]. По данным Российскогоцентра акушерства, гинекологии и перинатологии более 4 млн. мужчин в РФстрадают бесплодием. Бесплодие в браке в других странах имеет сравнимыепоказатели [Сухих Г.

Т. и др., 2008]. Следует отметить, что только 34% населениянашей странызнаетосуществованиимужскогобесплодия,остальныеубеждены, что оно бывает только женским [Троицкой И.А. и др., 2001].Благодаря революционному развитию вспомогательных репродуктивныхтехнологий (ВРТ) программа экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) внастоящеевремяявляетсясамымэффективнымметодомлечениябесплодия. Вместе с тем согласно опубликованным в 2013 г. данным Российскойассоциации репродукции человека (РАРЧ), в 2011 году только 36,6% пациентокзабеременели после проведения процедуры ЭКО и 25,8% женщин, прошедшихпроцедуру ЭКО, родили ребенка [РАРЧ, 2011].3Стремительное развитие ВРТ дало возможность иметь детей при формахбесплодия, которые ранее считались абсолютно бесперспективными для лечения[Кулаков В.И., Леонов Б.В., 2005], что, прежде всего, обусловлено достижениямимолекулярной генетики и эмбриологии.

Распространяются в клиническойпрактике методики ИКСИ (от англ. ICSI — Intra Cytoplasmic Sperm Injection:введение сперматозоида всперматозоида),цитоплазму,криоконсервацияинтрацитоплазматическаяипредимплантационнаяинъекциягенетическаядиагностика эмбрионов, в частности, предимплантационный генетическийскрининг эмбрионов (ПГС) на наличие анеуплоидий или других мутаций еще допереноса эмбриона, т.е. до наступления беременности [Harper J.

C., SenGupta S.B., 2011].Важнейшей задачей программы ВРТ является рождение здорового ребенка.Однако большинство исследований свидетельствует о том, что частотахромосомных нарушений эмбрионов, полученных методом ВРТ, чрезвычайновысока. Многие ученые полагают, что именно наличие у эмбрионов хромосомныханомалий обусловливает низкую эффективность имплантации и частую потерюбеременности, наблюдаемые при реализации ВРТ. В этой связи необходимостьдиагностики возможных генетических нарушений сделала актуальным развитиемолекулярно-генетическихметодовпредимплантационногогенетическогоанализа эмбрионов [Екимова Е. В.

и др., 2012].Технология сравнительной геномной гибридизации (СГГ) в последние годыстала активно применяться в медицине. За рубежом этот метод широкораспространился в рутинной практике лабораторий ВРТ и получил название CGH(comparative genome hybridization). Ряд исследований показал, что эффективностьвыявленияанеуплоидийспомощьюметодасравнительнойгеномнойгибридизации по сравнению с методом FISH (флуоресцентная гибридизация insitu) выше на 20-25%. Более того, кроме численных аномалий с помощью СГГвыявляются и другие хромосомные нарушения, не обнаруживаемые прииспользовании FISH, такие как многие делеции и амплификации участков4хромосом.

Показано, что применение данного метода повышает результативностьпрограммы ВРТ [Traversa M.V.et al., 2011].Существуют многочисленные исследования, посвященные сравнениюгенетических характеристик и морфологии эмбрионов, в которых авторы статейнезависимо друг от друга приходят к выводу, что значительные хромосомныенарушения в геноме эмбриона зачастую не отражаются на морфологии эмбрионовстоль ранних стадий развития, так как большинство генов, содержащихся ваномальных хромосомах, еще не проявили себя в доимплантационных эмбрионах[Chow J.F. et al., 2014].Также много исследований посвящено схемам гормональной стимуляции уженщин, участвующих в цикле ВРТ с ПГС. Их результаты показываютсущественное влияние состояния ооцитов на результаты ПГС полученныхэмбрионов.

Важнейшими факторами являются возраст женщины, вступившей впрограмму ВРТ, ее гинекологический и соматический анамнез [Zech N.H.etal., 2015]. Принимая во внимание существенный вклад материнского генома вгенетические характеристики будущего эмбриона, исследователи предлагаютперед проведением оплодотворения методом ИКСИ анализировать полярныетельца яйцеклеток и выбирать только яйцеклетки, несущие «правильный» наборхромосом [Scriven P.N.

et al., 2012]. Вместе с тем большое количество данных поотцу не учитывается, хотя нельзя забывать, что генетический материалполученного эмбриона в равной степени состоит из генов отца и матери, и успехвынашивания и рождения здорового ребенка зависит от функционирования обоихгеномов. Имеются данные о влиянии той или иной патологии сперматозоидов наэффективность зачатия и последующее вынашивание плода [Jungwirth A. et al.,2012]. Обращают на себя внимание работы, свидетельствующие о наличиигенетической основы различных патологических состояний сперматозоидов, вчастности, таких как азооспермия и олигоастенотератоспермия (изменениеконцентрации, подвижности и морфологии сперматозоидов) [Брагина, Е.Е. исоавт., 2015; Damyanova V. et al., 2012].5В мировой практике приобретает популярность и все чаще используется вдиагностике мужского бесплодия анализ фрагментации ДНК ядра сперматозоида.Ряд исследователей придерживается мнения о значимой роли фрагментации ДНКядра в ранней потере беременности как при естественном зачатии, так и послеЭКО [Robinson L.

et al., 2012]. Есть данные о замедлении темпов развития раннихэмбрионов у пар с такой патологией [Wdowiak A. et al., 2015]. Также известно обувеличении числа хромосомных аномалий в сперматозоидах пациентов сповышенным уровнем фрагментации ядра [Enciso M. et al., 2013].Совсем недавно начали появляться первые публикации о влиянии геномныхнарушений в сперме на генетический метериал 3-дневных эмбрионов [Kaarouch I.et al., 2015].Таким образом, исследования, посвященные изучению и сравнительномуанализу функциональных показателей отцовских сперматозоидов и результатовпредимплантационного генетического скрининга эмбрионов, актуальны ипредставляют значительный научный и практический интерес.Цель работыИсследовать влияние функциональных показателей сперматозоидов отца нарезультатыпредимплантационногогенетическогоскринингаэмбрионов,выполненного методом сравнительной геномной гибридизации на чипах.Задачи исследования1.Оценить концентрацию, подвижность и морфологию сперматозоидовотца в парах, прошедших программу ИКСИ с ПГС эмбрионов.2.Оценить уровень фрагментации ДНК ядра сперматозоидов методомTUNEL.3.Проанализировать результаты полногеномного скрининга эмбрионовметодом СГГ на чипах.4.Исследовать возможность наличия ассоциации нарушений кариотипаэмбрионов с функциональными показателями сперматозоидов отца.6База проведения научного исследованияФедеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центракушерства, гинекологии и перинатологии имени В.И.