Диссертация (Роль функциональных показателей сперматозоидов отца в программах предимплантационного генетического скрининга эмбрионов), страница 9

Каждое поле зрения фотографируется при разных длинах волн, длявыявления фрагментированных ядер сперматозоидов (560 нм) и визуализацииядер всех сперматозоидов на препарате (350 нм).Полученные изображения анализируются в программе Image Pro дляподсчета количества ядер сперматозоидов с фрагментацией ДНК и общегоколичества неповрежденных ядер. Подсчитывается процент (среднее значение)фрагментированных ядер в препарате данного пациента.Оптимизация и компьютерная визуализация данного метода произведены сучастием автора исследования (рис. 3, 4).44Рис.3.Ядра(rhodamine),сперматозоидов, окрашенныепозволяющим(фрагментированной) ДНКвизуализироватьфлуоресцентнымядраскрасителемповрежденной[Фотоархив Отделения Репродукции ФГБУ НЦ«АГиП им.

В.И. Кулакова МинЗдрава России].Рис. 4. Ядра сперматозоидов, окрашенные флуоресцентным красителем DAPI,(окрашиваются все ядра, чтобы определить соотношение ядер с нормальной ифрагментированной ДНК) [Фотоархив Отделения Репродукции ФГБУ НЦ «АГиПим. В.И. Кулакова МинЗдрава России].452.2.3. Пункция фолликулов, получение и подготовка яйцеклеток коплодотворениюОоцит-кумулюсный комплекс (OКК) – это комплекс клеток, которыйнаходится в фолликулярной жидкости, полученной в процессе аспирациифолликула. OКК включает в себя ооцит, покрытый прилегающей к нему коронойиз клеток кумулюса. Оценка зрелости яйцеклеток в составе ОКК проблематична,потому что цитоплазма яйцеклетки и полярные тела плохо видны.Пункция фолликулов направлена на получение ооцитов из фолликулярнойжидкости.Кумулюс (cumulus)- наружная масса клеток, окружающих ооцит. Подмикроскопом она выглядит как ярко-голубая масса клеток.

Данные клеткиреагируют на гормональную стимуляцию, производя внеклеточный матрикс,содержащий гиалуроновую кислоту.Клетки гранулезы - клетки, которые попадают из фолликула. Они могутбыть найдены в фолликулярной жидкости в большом количестве в видеотдельных клеток и групп. Клетки гранулезы обычно темнее, чем кумулюсныеклетки.Аспирация фолликулов выполняется с помощью аспираторной иглы и спомощью вакуумного отсоса под контролем ультразвука и является первымлабораторным этапом цикла ЭКО.Ооциты созревают в фолликулах яичников. Для получения большого числаооцитов применяется искусственная контролируемая стимуляция яичниковгормональными препаратами ФСГ.

За 36 часов до предполагаемой пункциифолликуловназначаетсяпрепаратХГЧдляокончательногосозреванияяйцеклеток. Пункция фолликулов и аспирация фолликулярной жидкостипроизводятся непосредственно перед предполагаемым временем овуляции.Фолликулярную жидкость собирают в пробирки, установленные в обогревающийблок. Задача эмбриолога состоит в поиске ооцитов в фолликулярной жидкости,промывке от крови и фолликулярной жидкости и помещении ооцитов в чашку сосредой культивирования.

Всю процедуру следует выполнять быстро, чтобы не46переохлаждатьооцитыдопомещенияихвинкубатор.Все необходимые материалы для сбора ооцитов должны быть подготовлены доначала процедур пункции фолликулов. Перед пункцией фолликулов пациентдолжен быть идентифицирован: необходимо проверить соответствие имени иперсонального идентификационного номера с данными на первой страницеэмбриологического протокола. Эта процедура всегда должна быть сделана личноэмбриологом.

Пункция фолликулов и поиск ооцитов должны быть выполнены встерильных условиях: необходимо использовать стерильные перчатки, шапочку имаску, работать в ламинарном шкафу с использованием одноразовых пипеток инаконечников.Процедура сбора ооцитов должна быть выполнена с высокой точностью,необходимо быстро найти и отобрать все ооциты из фолликулярной жидкости.Для промывки аспирационной системы и иглы используют промывочную среду.Некоторые ооциты могут остаться в системе.

Сборооцитов должен бытьвыполнен как можно быстрее, чтобы избежать длительного пребывания ооцитоввне инкубатора.Должны быть подготовлены два вида чашек со средами: одна с Flashingmedium (промывочная среда) и вторая с Universal IVF medium (универсальнаясреда для оплодотворения). Все чашки и пробирки для сбора ооцитов готовятнакануне в конце рабочего дня.

Чашки помещают в CO2-инкубатор дляэквилибрациигазовойсреды.Дополнительнонебольшоеколичествопромывочной среды должно быть оставлено в пробирке в инкубаторе.Оборудование и инструменты:1. Ламинарный шкаф с подогреваемой поверхностью или бинокулярныймикроскоп, с подогреваемым предметным столиком (температура не ниже 37,4°С).2. СО2-инкубатор (T 37,2 °C; 6,0% СО2 и максимальная влажность)3. Термоблоки для пробирок 5 мл и 14 мл, предварительно нагретые в инкубаторе4. Пипетка с переменным объемом 100-1000 мкл5.

Пипетка с переменным объемом 5-50 мкл47Среды:-Universal IVF medium (Origio) или аналогичная среда для оплодотворения-Flushing medium (Origio) или аналогичный буфер другого производителяПодготовка чашек и пробирок для пункции за день до пункции:Поверхность стола ламинарного шкафа промывают стерильной водой изатем обрабатывают 70% спиртом.

Чашки готовят в ламинарном шкафу безвключения подогрева стола. Для промывки ооцитов готовят чашки Петри с 4 млхолодной (из холодильника) Flushing medium. Количество чашек должно бытьрассчитано в зависимости от числа ожидаемых ооцитов (4-6 ооцитов на чашку).Подготавливают чашки с 4 мл холодной Universal IVF medium для второйпромывкиооцитов(4-6ооцитовначашку).Подготавливают чашки с 4 мл холодной Universal IVF medium для сбора ооцитов(4-6 ооцитов на чашку). Дно и крышку чашек подписывают именем пациентки.Подготавливают две дополнительные чашки со средой Universal IVF medium безподписи.Подготавливают пробирки (Falcon, 14 ml) с 9-10 мл Flushing Medium(холодной) - по одной для каждой пункции.

Одна пробирка оставляетсядополнительно на каждый день пункций.Чашки и пробирки ставят на ночь в CO2-инкубатор для эквилибрации рН.Для поиска ооцитов в аспирированной фолликулярной жидкости во времяпункции необходимы пустые чашки Петри диаметром 60 мм. Их предварительнонеобходимо положить в инкубатор на нижнюю полку для прогревания.После промывки ооциты собирают в чашки с Universal IVF medium. Чашки сосредой для ооцитов помеченные именем пациента подготавливают за день допункции. Одна-две неподписанные чашки с Universal IVF medium должны бытьготовы на случай, если будет получено больше ооцитов.Во время процедуры сбора ооцитов сначала клетки промывают в средеFlushing medium, а затем в Universal IVF medium, прежде чем перенести их вкультуральную чашку.

После промывки их собирают в чашки с Universal IVF48medium. Чашки, содержащие Universal IVF medium с ооцит-кумулюснымикомплексами должны быть быстро поставлены в инкубатор с 6,0% СО2.2.2.4.Метод интрацитоплазматической инъекции сперматозоида вооцит (метод ИКСИ)Метод ИКСИ относится к наиболее сложным в цикле ВРТ. Он необходимдля последующего проведения предимплантационного генетического скрининга,так как метод ЭКО может ввести дополнительный генетический материал на зонупеллюцида яйцеклетки. Также применение метода ИКСИ оправдано дляразличных случаев мужского бесплодия, таких как ослабление подвижности,малая концентрация сперматозоидов в эякуляте, а также высокий уровеньфрагментации ДНК ядра сперматозоидов.Схема обработки спермы для программ ИКСИ1. Поставить на разжижение: не более 30 мин, 37°С, периодически перемешивая.2. Оценить количество и качество в камере Маклера, для чего нужно взять 6 мклэякулята.I.

Если количество сперматозоидов категории A+B менее 2-5 млн/мл (низкаяподвижность) добавить 3 мл Sperm.Prep. medium (если объем нативного эякулятаболее 3 мл – разделить на 2 пробирки).I.1. Центрифугировать 10 мин при 300 g.I.2. Быстро снять надосадочную жидкость, осадок ресуспендировать в 200-500мкл Sperm.Prep. medium в зависимости от величины осадка.I.3. Оценить качество в камере Маклера. Развести до 1 млн/мл.I.4. Заполнить протокол и отдать на оплодотворение.II.

Если количество сперматозоидов категории A+B более 5-10 млн/млII.1. Наслоить на градиент плотности (снизу вверх: 2 мл 90% градиент, 2 мл 45%градиент, 2 мл эякулята), центрифугировать 18-20 мин при 300 g.II.2. Снять надосадочную жидкость, ресуспендировать осадок в 3 мл Sperm. Prep.,центрифугировать 10 мин при 300 g.49II.3.Снять надосадочную жидкость и быстро перенести в чистую пробирку.II.4. Осадок подслоить в круглодонную пробирку с 1,5 мл IVF. Поместить винкубатор на 30 мин при 37С.II.4.