Диссертация (Генетический контроль ранних этапов биосинтеза хлорофилла у зелёной водоросли Chlamydomonas reinhardtii), страница 11

Сейчас известно, что кодируемые этими генамибелки не входят в состав ферментного комплекса тПОР. Эксперименты, в которыхбыло показано, что способность мутантов yellow хламидомонады зеленеть насвету может быть блокирована ядерной мутацией pc-1, послужили поводомговорить о сосуществовнии двухгенетическиразличных (темнового исветозависимого) путей восстановления ПХЛД.СветонезависимоевосстановлениеПХЛДуаноксигенныхфототрофных бактерий обеспечивается продуктами генов bchB, bchL и bchN.Основные сведения о генетическом контроле темнового биосинтеза ХЛД изПХЛД были получены при анализе пигментных мутантов бактерий родаRhodobacter.

Эти несерные пурпурные бактерии способны к аноксигенномуфотосинтезу и независимо от света образуют БХЛa. Мутанты факультативныхфототрофов R. sphaeroides и R. capsulatus с разными дефектами фотосинтеза ибиосинтеза пигментов стали предметом генетического анализа, в результатекоторого был выявлен участок хромосомы протяженностью в 46 тпн, названный«фотосинтетическим генным кластером». Он состоит более чем из 40 генов,отвечающих за фотосинтетические функции [Zsebo and Hearst, 1984], и содержит56всюгенетическуюинформацию,необходимуюдлясинтезаБХЛизпротопорфирина IX (рисунок 1.13А).Рисунок 1.13А. Структура фотосинтетического генного кластера R.

sphaeroides2.4 (по: Choundhary and Kaplan, 2000). bch - гены биосинтеза бактериохлорофилла.Стрелки указывают направление транскрипции геновСреди индуцированных пигментных мутантов R. capsulatus были ибесхлорофильныештаммы,накапливающиеПХЛД.Ихмолекулярно-генетический анализ позволил найти три гена  bchB, bchL и bchN, мутации вкоторых блокируют темновое восстановление ПХЛД [Burke et al., 1993], ипредположить, что кодируемые ими полипептиды являются субъединицамифермента, получившего называние темновой - не зависящей от света,оксидоредуктазы (тПОР).

При этом выяснилось, что ген bchL кодирует белок,гомологичный субъединице NifH нитрогеназы бактерий [Hearst et al., 1985].Хлоропластный ген frxC - поиски функций. Одну из проблем изучениятемнового биосинтеза ХЛ удалось решить путем сравнительного анализануклеотидных последовательностей пластидных геномов печеночника Marchantiapolymorpha и двух представителей покрытосеменных растений: табака Nicotianatabacum и риса Oryza sativa.

Большинство из них были сходными, но ОРС,57первоначально названную frxC (благодаря структурному сходству продукта этогогена с ферредоксином бактерий), удалось найти только в пластидном геноме M.Polymorpha [Ohyama et al., 1986]. Ее нуклеотидная последовательность оказаласьгомологичнойгенуR.capsulatus,кодирующемуNifH–-субьединицунитрогеназы [Fujita et al., 1989]. Присутствие гена frxC в пластидном геномепеченочника казалось парадоксом, поскольку ядерные организмы не способныфиксировать молекулярный азот.

В дальнейшем, когда ортологи гена frxC былиобнаружены в пластидных геномах зеленеющих в темноте растений  сосен изеленой водоросли C. reinhardtii, появились предположения, что продукты этихгенов вовлечены не в процесс фиксации азота, а необходимы для восстановленияПХЛД в темноте [Lindholm and Gustafsson, 1991; Huang and Liu, 1992].Некоторые пластидные геномы содержат гены, кодирующие ПОР.Существенную роль в изучении генетического контроля темнового биосинтезаХЛ сыграли мутанты yellow хламидомонады. Помимо ядерных мутаций, у этойводоросли была описана хлоропластная мутация, приводящая к фенотипу yellow[Александрова, 1979].

В дальнейшем подобные мутанты получали в результатеинсерционного мутагенеза [Roitgrund and Mets, 1990]. Ортологи одного из такихделетированных хлоропластных генов gidA хламидомонады (сокр. англ.:nogreenin-the-dark) вскоре были найдены в пластидных геномах нескольких видов сосны,где они оказались сцепленными с геном frxC [Lindholm and Gustafsson,1991].Сходное взаимное расположение этих генов (рисунок 1.13Б) было установлено впластидномгеномеM.polymorphaинахромосомецианобактерииSynechocystissp.PCC6803 [Ogura et al., 1992].Прямое участие генов frxC (сhlL) и gidA (сhlN) в темновом биосинтезе ХЛудалось показать при анализе фенотипов инсерционных мутантов C. reinhardtii[Suzuki and Bauer, 1992; Choquet et al., 1992] и азотфиксирующей цианобактерииPlectonema boryanum – Lyngbya sp.

PCC7419 [Fujita et al., 1992; 1993]. Более того,как и в случае с гомологией продукта гена сhlL и полипептида NifH было58установлено, что белок, кодируемый геном сhlN, имеет высокую степень сходствас белками NifD и NifK, являющимися- и -субъединицами MoFe-белканитрогеназы бактерий [Fujita et al., 1993].Рисунок 1.13Б. Структурное расположение генов, кодирующих тПОР.На диаграмме показаны ориентация и взаиморасположение генов тПОР вхромосомах аноксигенных бактерий (bchB,bchL, bchN), оксигенных бактерий и вхлоропластных геномах ядерных фототрофов (chlB, chlL chlN), синтезирующиххлорофилл в темноте.

Гены bchH и bchM кодируют субъединицу H магний-хелатазыи фермент магний-ПП- метилтрансферазуПрямое участие генов frxC (сhlL) и gidA (сhlN) в темновом биосинтезе ХЛудалось показать при анализе фенотипов инсерционных мутантов C. reinhardtii[Suzuki and Bauer, 1992; Choquet et al., 1992] и азотфиксирующей цианобактерииPlectonema boryanum – Lyngbya sp. PCC7419 [Fujita et al., 1992; 1993].

Более того,как и в случае с гомологией продукта гена сhlL и полипептида NifH былоустановлено, что белок, кодируемый геном сhlN, имеет высокую степень сходствас белками NifD и NifK, являющимисянитрогеназы бактерий [Fujita et al., 1993].- и -субъединицами MoFe-белка59В 1993 г. в пластидных геномах M. polymorpha и С. reinhardtii былиобнаружены ортологи гена bchB (сhlB) R. сapsulatus. Функциональный анализинсерционных мутантов хламидомонады и цианобактерий по этому гену показал,что белок, кодируемый геном сhlB, необходим для восстановления ПХЛД втемноте, а его первичная структура имеет сходство с аминокислотнойпоследовательностью белков NifK и ChlN [Li et al., 1993, Fujita et al., 1996].Способность зеленеть в темноте коррелирует с наличием генов chlB,chlL иchlN в хлоропластных геномах. Коль скоро было установлено, чтохлоропластные гены: сhlB, сhlL и сhlN контролируют темновое восстановлениеПХЛД, возник вопрос, - коррелирует ли наличие этих генов со способностьюобразовывать ХЛ в темноте? ДНК-ДНК гибридизация, основанные на ПЦРметоды идентификации определенных участков ДНК и прямое сравнениенуклеотидных последовательностей хлоропластных геномов  все эти методыбыли использованы для поисков генов сhlB, сhlL и сhlN у различныхфотосинтезирующих организмов.

В геномах всех изученных к настоящемувремени покрытосеменных растений их не обнаружено. В то же время онинайдены в хлоропластной ДНК голосеменных растений, за исключениемпредставителей семейства гнетофитов  гнетума (Gnetum gnemon) и вельвичииудивительной(Welwítschiamirábilis),незеленеющихвтемноте,папоротникообразных (кроме усатых папоротников) и водорослей. Не оказалосьэтих генов у E. gracilis и бурой водоросли Odontella sinensis, которые несинтезируют ХЛ в темноте [Armstrong, 1998]. Таким образом, выяснилось, что длятемнового синтеза ХЛД из ПХЛД необходимо наличие в хлоропластных геномахгенов сhlB, сhlL исhlN.

Исключением из этого правила является гинкгодвулопастный (Ginlgo biloba) - реликтовый представитель голосеменных,проростки и листья которого не способны зеленеть в темноте, несмотря наналичие всех трех генов [Richard et al., 1994; Mc Coy et al., 2008]. Объясненияэтому феномену до сих пор не найдено.60Регуляция синтеза тПОР.

Данные о регуляции экспрессии генов,кодирующихсубъединицытПОР,покаоченьфрагментарныисильноразличаются в зависимости от таксономической принадлежности изучаемогоорганизма. Транскрипция гена chlL у цианобактерии P. boranyum имеет местотолько при подавлении нитрогеназной активности [Fujita et al., 1991]. Этот фактпозволил заключить, что связанный азот и (или) молекулярный кислород,которые ингибируют фиксацию азота  необходимые предпосылки экспрессииэтого гена у цианобактерий.Транскрипты хлоропластных генов сhlB, сhlL и сhlN хламидомонадыодинаково присутствуют в клетках дикого типа и мутантов yellow, растущих и насвету и в темноте, хотя уровень их накопления при освещении оказывается в 2-4раза выше.

Белки ChlN и ChlB также выявляются в сходных количествах вклетках дикого типа и мутантов yellow, растущих и на свету и в темноте, а белокChlL - только у дикого типа в темноте. Ядерные мутанты yellow не содержат белкаChlL за исключением мутанта y-7, который синтезирует иммунореактивныйполипептид меньшего размера [Cahoon and Timko, 2000]. На основе этихрезультатов был сделан вывод, что у C.

reinhardtii синтез белка ChlL негативнорегулируется светом, а ядерные гены yellow контролируют его образование илинакопление.В клетках мха печеночника Marchantia paleace, которые одинаково хорошозеленеют в темноте и при освещении, содержание мРНК генов сhlB, сhlL и сhlN независит от света [Takio and Satoh, 1995]. Изучение регуляции темновогобиосинтеза ХЛ у зеленых в темноте проростков ели Piceaabies и лиственницы L.decidua, способных накапливать ХЛонтогенеза,показало,чтоуобоихв темноте только на ранних стадияхвидовгены,кодирующиетПОР,экспрессируются конститутивно.

Различия были найдены на уровне белков, пожелтение проростков лиственницы оказалось обусловленным снижениемуровня содержания белка CHLB [Demko et al., 2009].61тПОР сходны с нитрогеназами бактерий. Cтруктура тПОР консервативна.Онасохраняласьвтечениемиллиардовлетэволюции.Идентичностьаминокислотной последовательности белков BchL, BchB и BchN у R. capsulatus стПОРцианобактерий,зеленыхводорослей,папоротникообразныхиголосеменных растений составляет 3060%.