Диссертация (Генетический контроль ранних этапов биосинтеза хлорофилла у зелёной водоросли Chlamydomonas reinhardtii), страница 6
Описание файла
Файл "Диссертация" внутри архива находится в папке "Генетический контроль ранних этапов биосинтеза хлорофилла у зелёной водоросли Chlamydomonas reinhardtii". PDF-файл из архива "Генетический контроль ранних этапов биосинтеза хлорофилла у зелёной водоросли Chlamydomonas reinhardtii", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "биология" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве СПбГУ. Не смотря на прямую связь этого архива с СПбГУ, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой докторскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени доктора биологических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст 6 страницы из PDF
Номерами обозначены ферменты,перечисленные в таблице 1.231Таблица 1.2. Генетический контроль ферментов биосинтеза хлорофилла№ФерментGLUA.thalianaGTSHEMA1HEMA2HEMA3ГеныбактерииgltXHemAChlamyGtsGtrОбозначениеферментаGluRS, EC 6.1.1.17GluTR, EC 1.2.1.7012Глутамил-тРНК-синтетазаGLUГлутамил-тРНК-редуктаза3Глутамат-1-полуальдегидаминотрансферазаАЛК-дегидратазаGSA1GSA2ALAD1ALAD2HemLGsaGSA-AT, EC 5.4.3.8HemBAladPBGS, EC 4.2.1.24567ПорфобилиногендеаминазаУропорфириноген III-синтетазаУропорфириногендекарбоксилазаPBGDUROSUROD1UROD2HemCHemDHemEPBGD, EC 4.1.3.8UROS, EC 4.2.1.75UROD, EC 4.1.1.378*КопропорфириногеноксидазаCPO1CPO2HemFHemNPbgdUrosUrod1Urod2Urod3Cpx19*ПротопорфириногеноксидазаMg-хелатаза H субъединицаMg-хелатаза D субъединицаMg-хелатаза I субъединицаHemGHemYBchHBchDBchI11Mg-протопорфирин IXметилтрансферазаMg-протопорфирин IXмонометиловый эфир циклазаCHLMBchMPpx(Ppo)ChlHChlDChlI1ChlI2ChlI3ChlMPPOX, ЕС 1.3.3.410PPO1PPO2CHLHCHLDCHLI1CHLI2CRD1(CHL27)AcsFBchECth1Crd1Mg-PPMT,EC 2.1.1.11Mg-PPME,EC 1.14.13.81Дивинил-редуктазаСветозависимая НАДФпротохлорофиллидоксидоредуктаза (сПОР)Темновая протохлорофиллидоксидоредуктаза (тПОР)DVRPORAPORBPORCBchJBchYBchZDvrLporDVR, EC 1.3.1.75POR, ECI.3.1.33.ChlL,ChlBChlNdPORХлорофилл-синтетазаХлорофиллид а-оксигеназаCHLGCAOBchLBchBBchNBchG412*1314171516CaoCPOX, EC 1.3.
3.3EС 6.6.1.1CHLS, EC 2.5.1.62CAO, EC 1.13.12.14В таблице номера ферментов соответствуют таковым на рисунке 1.8* ферментативные реакции, проходящие в аэробных и анаэробных условиях.Chlamy – зеленая водоросль Chlamydomonas reinhardtii32I.3.1. Ферменты биосинтеза хлорофиллов.
Генетические исследованияПрименение генетических методов позволило не только найти гены,кодирующие ферменты метаболизма природных тетрапирролов: ХЛ и гема(таблица 1.2), но и охарактеризовать их структуруисвойства [Beale, 1999; Masudaand Fujita, 2008]. У фотосинтезирующих эукариот биосинтезы хлорофиллов икаротиноидов идут в хлоропласте. Подавляющее большинство ферментов,участвующих в этих процессах, кодируются ядерными генами, синтезируются вцитоплазме как предшественники, имеющие в N-концевой части хлоропластныетранзитные пептиды, и транспортируются в хлоропласт.
В пути биосинтезамолекул хлорофиллов можно выделить 3 этапа:1. синтез 5-аминолевулиновой кислоты (АЛК) - первого специфическогопредшественника всех тетрапирролов;2. превращение АЛК в протопорфирин IX (ПП) – последний общийпредшественник гема и хлорофиллов;3. специфические реакции синтеза хлорофиллов.Последовательно рассмотрим каждый из них.1.3.1.1.
Синтез АЛКИзвестны два способа образования АЛК, которые носят названия С4 и С5пути. Все эукариоты, не имеющие хлоропластов, и α-протеобактерии (включаяфототрофные бактерии рода Rhodobacter) используют С4 – путь (путь Шемина),который состоит в конденсации глицина и сукцинил-КоА ферментом АЛКсинтетазой (ALAS) [Astner et. al., 2005]. В клетках нефотосинтезирующихэукариот АЛК образуется в митохондриях и служит для биосинтеза гема ицитохромов. Формирование АЛК у содержащих хлорофилл эукариот и всехпрокариот (за исключением α-протеобактерий) идет по С5-пути из 5-углеродногопредшественника – глутаминовой кислоты.
Он включает три энзиматическиереакции,вкоторыхучаствуют4функционально-активныемолекулы,локализованные в строме пластид: 3 фермента и глутаминовая транспортная РНК33- тРНКGLU. Оба пути биосинтеза АЛК (С4 и С5) функционируют у зеленыхводорослей: сценедесмуса (Scenedesmus obliquus) и эвглены (Euglena gracilis)[Klein and Senger, 1978; Foley et al., 1982].Генетический контроль синтеза АЛК (С5-путь)На первом этапе С5-биосинтеза фермент глутамил-тРНК синтаза(glutamyl-tRNA synthase - GluRS) присоединяет глутаминовую тРНК сантикодоном UUC,к глутамату (реакция 1, рисунок 1.8). Затем следуетредукция глутамил-тРНКGlu в глутамат-1-полуальдегид с освобождениемтРНКGlu ферментом глутамил-тРНК редуктазой (glutamyl-tRNA reductase –GluTR) в присутствии NADPH и Mg2+ (реакция 2, рисунок 1.8).
Далее,аминотрансфераза (glutamate-1-semialdehyde aminotransferase - GSA-АT) cкофакторомпиридоксальфосфатомосуществляюттранс-аминированиеглутамат-1-полуальдегида за счет переноса С4 аминогруппы в положение С5 собразованием АЛК (реакция 3, рисунок 1.8).Ферменты С5-пути оказались настолько сходными для всех, изученных кнастоящему времени видов растений, водорослей и бактерий, что реакционныекомпоненты из разных биологических источников, объединенные in vitro,способны синтезировать АЛК [Timko, 1998].Глутаминовая тРНК, активируя глутамат, запускает процесс биосинтезатетрапирролов [Huang et al., 1984; Schon et al., 1986; Schneegurt, Beale, 1988].Критическая роль этой молекулы в синтезе ХЛ была показана при изучениибесхлорофильного оранжевого мутанта эвглены, у которого причиной отсутствияпигмента оказалась точковая мутация, приведшая к замене (С-56-U) в Т-петлетРНКGLU [Stange-Thomann et al., 1994].
Гены, кодирующие эту транспортнуюРНК, у всех фотосинтезирующих эукариот консервативны и локализованы вхлоропластной ДНК (хлДНК). Поиски тРНК, специфичных для синтезатетрапирролов, к настоящему времени не увенчались успехом, и представление о34том, что одни и те же молекулы участвуют в образовании АЛК и синтезе белков[Kumar, et al., 1996], остается актуальным.
Исключением из этого правила сталабактерия Acidithiobacillus ferrooxidans, у которой один из трех генов tRNAGLUкодирует молекулу, не имеющую сродства к ферменту GluTR [Levicán et al.,2005]. В хлДНК хламидомонады обнаружено два гена тРНКGLU с разными 5‘фланкирующими последовательностями, но функциональных различий междукодируемыми ими молекулами найти не удалось [O'Neill et al., 1990; Khrebtukovaand Spreitzer, 1994].
В хлоропласте тРНКGLU узнается тремя белками: GluRS,GluTR и фактором элонгации EF-Tu, и, по-видимому, служит предметомконкурирования синтезов белков и тетрапирролов, координируя тем самым, обаэтихпроцессаприформированиипигмент-белковыхкомплексовфотосинтетических мембран. В 2005 году было установлено ее участие врегуляции транскрипции генов хлоропласта [Hanaoka et al., 2005], которую ведутдвеРНК-полимеразы:NEP(nuclearencodingRNApolimerase)иPEP(plastidencoding RNA polimerase), кодируемые, соответственно, геномами ядра ихлоропласта.
В процессе индуцируемого светом синтеза хлоропластных мембрантРНКGLU, связываясь с NEP, ингибирует ее активность, и, тем самым,осуществляет переключение на PEP, которая преимущественно транскрибирует«фотосинтетические гены» - гены, продукты которых необходимы дляфотосинтеза.Фермент глутамил-tРНК-синтетаза (GluRS) не является специфичным длясинтеза тетрапирролов и, как и остальные аминоацил-тРНК-синтетазы, участвуетв синтезе белков.GluTR-первыйферментбиосинтезатетрапирролов.Историяклонирования генов, кодирующих глутамил-тРНК-редуктазу (GluTR), началась в1989годусэкспериментовпотрансформациимутантаhemAE.coli,ауксотрофного по АЛК, геномной библиотекой E.coli.
В результате былиполучены прототрофные трансформанты, у которых фрагмент ДНК, встраивание35которого вело к компенсации эффекта мутации hemA - восстановлению синтезаАЛК, содержал ген, кодирующий GluTR. Он получил название HemA [Li et al.,1989].Этимметодомгеномнойкомплементации-поспособностикомпенсировать мутантный фенотип штамма E.coli hemA [Pontoppidan andKannangara, 1994], гены, гомологичные HemA, были найдены у целого рядарастений (арабидопсиса, ячменя, огурцов и др.). GluTR - ключевой фермент врегуляциибиосинтезаХЛ.Егоактивностьингибируетсягемомипротохлорофиллидом через регуляторные белки [Srivastava et al., 2005].Экспрессию генов, кодирующих GluTR у растений и водорослей, контролируют:свет, растительные гормоны и циркадные ритмы [McCormac et al., 2001].Ферментглутамат-1-полуальдегидаминотрансфераза(GSA-AT).Впервые GSA-AT был выделен из стромы хлоропластов ячменя [Grimm et al.,1989].
Вслед за установлением первичной структуры, по последовательностиаминокислотэтогобелкабылисконструированыпраймерыдляПЦР-амплификации фрагмента кДНК кодирующего его гена, который послужилзондом для скрининга библиотеки кДНК. Итогом работы стало получение полнойнуклеотиднойпоследовательностигенаGSAT[Grimm,1990],которуюиспользовали далее для поиска генов, кодирующих этот фермент у E.coli ицианобактерии Synechococcus PCC 6311 [Grimm et al., 1991].К ауксотрофности по АЛК у E.coli приводят мутации в двух генах: ужеупомянутом HemA, кодирующем GluTR [Săsărman et al., 1968], и HemL, которыйпервоначально носил название PopC [Wulff, 1967].
Эксперименты по геномнойкомплементации мутанта popC показали, что дефектный у него ген HemLкодирует фермент GSA-АT [Ilag et al., 1991]. В дальнейшем, его ортологи былиизолированы у многих объектов [Timko, 1998].БелокGluTRпространственнаяпредставляетструктурасобойV-образныйдимер,предполагаетспособностькиегообразованиюстабильного комплекса с молекулой GSA-AT (рис. 1.9). Модель их совместного36функционирования [Moser et al., 2001; Lüer et al., 2005] подтверждают результатыэкспериментов in vitro - рекомбинантные белки обоих ферментов хламидомонадыобразуют физический и функциональный комплекс [Nogaj and Beale, 2005].Рисунок.