Диссертация (Генетический контроль ранних этапов биосинтеза хлорофилла у зелёной водоросли Chlamydomonas reinhardtii), страница 3

Исследования yellow-мутантовхламидомонады позволили обнаружить 3 хлоропластных (кодирующих тПОР) и12более десятка ядерных генов, контролирующих этот процесс [Li and Timko, 1996;Zhang, 2007]. Среди штаммов, неспособных синтезировать хлорофилл в темноте,помимо yellow-форм, были найдены мутанты C. reinhardtii, накапливающиеРисунок 3. Генетический контроль биосинтеза хлорофиллов у C.

reinhardtii.На схеме строчными буквами даны мутации, блокирующие его отдельные этапы;заглавными - гены ферментов: GTR – Glu-тРНК-редуктазы; GSA – глутаматполуальдегидаминотрансферазы;ALAD–АЛК-дегидратазы;CPX–копропорфириноген III оксидазы; PPX – протопорфириноген IX оксидазы;субъединиц магний-хелатазы (МХ): CHLH, CHLD, CHLI; POR – светозависимойНАДФ: ПХЛД-оксидоредуктазы (сПОР); субъединиц темновой ПОР: chlB, chlL,chlN; CAO – хлорофилл а/хлорофиллид а-оксидоредуктазы.

Ген trnE кодируетглутаминовую тРНК. В овалах - мутации, затрагивающие ранние этапы биосинтеза.13протопорфирины,-болееранние,чемПХЛД,егокоричневыепредшественники [Столбова, 1971; Wang et al. 1974]. Такой фенотип позволялпредполагать, что продукты генов, нарушенных мутациями, необходимы дляфункционирования ранних этапов биосинтеза молекул хлорофилла. К моментуначалаработыуC.reinhardtiiбылиидентифицированывсегены,контролирующие как ферментативный синтез протопорфирина IX из глутамата,так и превращение протохлорофиллида в хлорофиллид (рисунок 3). Генетическаядетерминацияраннегоспецифическогоэтапабиосинтеза˗конверсиипротопорфирина IX до протохлорофиллида ˗ оставалась не изученной. Для ответана вопросы, ˗ каким образом осуществляется генетический контроль раннихэтапов путей биосинтеза ХЛ, и какова регуляторная роль генов, задействованныхв этом контроле? ˗ предстояло идентифицировать до сих пор неизвестные геныхламидомонады, вовлеченных в светонезависимый синтез хлорофилла, на этапах,предшествующих формированию протохлорофиллида.Целью работы стало выяснение молекулярно-генетических механизмов,контролирующие ранние этапы биосинтеза хлорофилла у одноклеточной зеленойводоросли C.

reinhardtii. Требовалось осуществить поиск и идентификацию генов,обеспечивающих превращение протопорфирина IX в ПХЛД, и выяснить их роль вфункционировании аппарата биосинтеза хлорофилла, решив следующие задачи:(1) осуществить генетико-биохимические исследования мутантов зеленойводоросли C. reinhardtii с нарушениями темнового биосинтеза Хл на этапах,предшествующих формированию ПХЛД, для поиска генов, контролирующихмутантный признак; (2) исследовать обнаруженные гены С.

reinhardtii, иидентифицировать кодируемые ими факторы, обеспечивающие ранние этапытемнового биосинтеза Хл; (3) изучить супрессию мутантных признаков дляпоиска альтернативных путей темнового синтеза хлорофилла у С. reinhardtii; (4)исследовать механизмы регуляции ранних этапов темнового синтеза хлорофиллав клетках С.

reinhardtii.14Методыисследования.Прекраснымобъектомгенетическогоибиохимического анализа метаболических путей формирования хлорофиллаявляются мутанты высших растений и водорослей, неспособные синтезироватьэтот пигмент [Granick 1948; Suzuki et al., 1997; Tanaka, 2007].Предметом представленных исследований стали пигментные мутантызеленой водоросли C. reinhardtii (рисунок 4) с блоком ранних этапов синтеза ХЛ,клетки которых накапливали более ранний, чем ПХЛДпредшественник хлорофилла– протопорфирин IX -субстрат фермента магний-хелатазы.

Для решенияпоставленных задач в работе использованы методыгенетики,биохимииимолекулярнойбиологии.Классический генетический анализ (тетрадный анализ,рекомбинационный и комплементационный тесты)незаменим для изучения наследования генов интереса иопределенияаллельностиизучаемыхмутаций.Рисунок 4.

Пигментныемутанты C. reinhardtii.Культуры растут втемноте на среде ТАР.Биохимические и биофизические методы позволяют определять пигментныйсостав и активности ферментов биосинтеза хлорофилла – магний-хелатазы икомплекса, синтезирующего АЛК (5-аминолевулиновую кислоту) у изучаемыхштаммовхламидомонады(мутантов,ревертантов,трансформантов).Клонирование генов интереса и изучение их экспрессии осуществлялосьметодамимолекулярнойбиологии(ПЦР-амплификация,генетическаятрансформация, Вестерн- и Нозерн-блот анализы) и методами биоинформатики.Научная новизна.

В работе получены фундаментальные знания огенетических механизмах регуляции темновых процессов биосинтеза ХЛ узеленой водоросли C. reinhardtii. Исследованы ядерные гены CHLH и LTS3 C.reinhardtii, мутации в которых нарушают биосинтез ХЛ и ведут к накоплениюклетками водоросли его интермедиата - протопорфирина IX (ПП). Установлено,что продукты этих генов необходимы для функционирования фермента магнийхелатазы (МХ), конвертирующего ПП в Mg-ПП. Мутации brs-1 и chl1 в гене15CHLH останавливают синтез ХЛ в условиях роста в темноте и на свету. Умутантов по гену LTS3 блокирован только темновой синтез ХЛ, но сохраняетсяспособность зеленеть на свету.

Впервые у зеленых водорослей осуществленоклонирование гена CHLH С. reinhardtii, кодирующего большую (H) субъединицумагний-хелатазы. Исследованы его структура и функции. Описан новыйрегуляторныйгенLTS3C.reinhardtii,кодирующийфакторактивациитранскрипции генов МХ в темноте. Молекулярно-генетические исследованиямутантов по гену LTS3 позволили установить, что кодируемый им белок –первый, обнаруженный у водорослей фактор транскрипции семейства GATA,непосредственно регулирующий экспрессию генов биосинтеза ХЛ. Изучениесупрессии мутаций в гене LTS3 привело к обнаружению двух новых ядерныхгенов: SUP3 и SUP-I.

Ген SUP3 кодирует фактор негативной регуляцииактивности магний-хелатазы, а продукт гена SUP-I активирует транскрипциюгена LTS3 и необходим для процесса зеленения – индуцированного светомсинтеза хлорофилла. Обнаружен новый хлоропластный ген хламидомонады Modu-25, продукт которого регулирует уровень содержания ПП в клетке.Теоретическаяипрактическаязначимость.Вработевпервыеустановлено, что темновой биосинтез хлорофилла у зеленой водоросли C.reinhardtii регулируется на уровне транскрипции – путем активации генов,кодирующих ферменты: магний-хелатазу (МХ) и АЛК-синтезирующий комплекс.Найдены ядерные гены LTS3 и SUP-I, кодирующие факторы транскрипционнойактивации МХ в темноте.

Клонирован ген CHLH большой субъединицы МХ C.reinhardtii. Описан хлоропластный ген Mod-u-25. Он кодирует регуляторныйфактор, обеспечивающий низкий уровень содержания фотосенсибилизаторапротопорфирина IX (ПП) в клетке путем подавления активности ферментовсинтеза АЛК. Разработан экспресс-метод оценки продуктивности по ПП штаммовC.

reinhardtii. На основе мутантов по гену CHLH с нарушенной регуляциейполучены штаммы-продуценты ПП, два из которых защищены авторскимисвидетельствами (№ 1369275, и № 1759231) и могут быть использованы для16микробиологическогосинтезафотосенсибилизаторапротопорфиринаIX,необходимого для диагностики и фотодинамической терапии рака и при созданииальтернативных источников энергии.Положения, выносимые на защиту:− Помимо темновой ПХЛД-оксидоредуктазы (тПОР), у зеленой водорослиC. reinhardtii биосинтез ХЛ в темноте обеспечивается путем транскрипционнойрегуляции генов магний-хелатазы (МХ) – фермента, конвертирующего ПП в MgПП в цепи биосинтеза хлорофилла.− Ген CHLH C. reinhardtii кодирует большую (H) субъединицу магнийхелатазы, а мутации brs-1 и chl1 в этом гене останавливают синтез ХЛ в условияхроста в темноте и на свету.− Ген LTS3 C.

reinhardtii кодирует фактор активации транскрипции геновМХ в темноте. Это первый, обнаруженный у водорослей фактор транскрипциисемейства GATA, регулирующий экспрессию генов биосинтеза хлорофилла.− Ядерный ген SUP3 C. reinhardtii кодирует фактор негативной регуляцииактивности магний-хелатазы, а продукт гена SUP-I активирует транскрипциюгена LTS3 и необходим для процесса зеленения – индуцированного светомсинтеза хлорофилла.– Продукт обнаруженного в работе хлоропластного гена Mod-u-25подавляет активность ферментов синтеза АЛК, препятствуя накоплениюфотосенсибилизатора ПП в клетке.Достоверность и апробация результатов.Основные результаты работыпредставлены в более чем 50 публикациях, 20 из которых - в рецензируемыхжурналах и изданиях, рекомендованных ВАК; двух авторских свидетельствах.Результаты работы были доложены на целом ряде международных научныхконференций:девятимеждународныхконференцияхпоклеточнойимолекулярной биологии хламидомонады (International Conference on the Cell andMolecular Biology of Сhlamydomonas) с 1994 по 2014 годы; на X и XV Конгрессахпо фотосинтезу (International Congress on Photosynthesis, 1995, 2010), на третьем17съезде сообщества EMBO (European Molecular Biology Organization, 2011).Материалы диссертации были представлены на следующих отечественныхконференциях: международная школа-конференция «Генетика микроорганизмови биотехнология» (Москва, 2006); съезде Вавиловского общества генетиков иселекционеров (Москва, 2009); на Пущинских чтениях по фотосинтезу (Пущино,2009); всероссийской конференции «Фотохимия хлорофилла в модельных иприродных системах» (Пущино, 2012); международной конференции ―Рольорганизации и экспрессии генетического материала в наследственной иненаследственнойизменчивости‖(Санкт-Петербург,2009),Пятоммеждународном конгрессе «БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективыразвития» (Москва, 2009).Структура работы и личное участие автора в получении результатов.Диссертация изложена на 336 страницах и состоит из следующих разделов:введение, обзор литературы (1), материалы и методы (2), экспериментальнаячасть (3.1 - 3.5), заключение, выводы и список цитируемой литературы (390наименований, из которых 50 – на русском языке).

Работа содержит 76 рисунков и49 таблиц. Все результаты данной работы получены лично автором. Генетическийанализ мутантов C. reinhardtii был проведен на кафедре генетики и селекциибиолого-почвенного факультета СПбГУ. Данные по анализу пигментов иактивности ферментов биосинтеза хлорофиллов представленные в диссертации,явились результатом плодотворного сотрудничества автора с сотрудникамилаборатории Биофизики и биохимии фотосинтетического аппарата институтаФотобиологии АН Республики Беларусь (д.б.н.: Н.В. Шалыго, Н.Г.

Аверина и Е.Б.Яронская). Часть молекулярно-генетических экспериментов была осуществленана базе лабораторий Германии: у проф. Бека (Ch. Beck, Fraiburg University) ипроф. Гримма (B. Grimm, IPK, Gatersleben) при поддержке европейских фондов:DFG, DAAD и EMBO (1997 – 2002 гг.). В 2009 – 2011 гг. исследования авторабыли поддержаны грантом РФФИ: 09-04-01646-а.18ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ1.