Диссертация (1144823), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Напротив, встраивание ионов Mg2+ впорфириновоеядроявляетсясложнойАТФ-зависимойреакциейиосуществляется только в хлоропласте [Walker and Willows, 1997].I.3.1.3. Магниевая ветвь биосинтеза тетрапирролов. Ранние этапыобразования хлорофилловКраннимэтапамбиосинтезаХЛотносятреакции,ведущиекформированию протохлорофиллида (ПХЛД) из протопорфирина IX (ПП). Онипроходят одинаково у всех фотосинтезирующих организмов.Магний-хелатаза – ключевой фермент биосинтеза ХЛ. ВстраиваниеMg2+ в молекулы ПП с образованием магний-протопорфирин IX (реакция 10,рисунок 1.8) ведет фермент магний-хелатаза (МХ). Это гетеромультимерныйкомплекс, состоящий из трех субъединиц: I, D и H, кодируемых, соответственно,генами:CHLI,CHLDиCHLH.Энзиматическаяреакцияначинается41сформирования Mg2+- и АТФ-зависимого комплекса субъединиц I и D, которыйвзаимодействует с субъединицей H, связывающей ПП (рисунок 1.10).Белки CHLI и CHLD имеют в своем составе N-концевые Mg-АТФсвязывающие модули AAA+ (ATPases Associated with diverse cellular Activities),при объединении формирующие три димерных структуры, конформация которыхРисунок.
1.10. Модель каталитического цикла магний-хелатазы. Работафермента делится на две фазы. В первой фазе (активации) происходит Mg2+ иАТФ-зависимое формирование кольцевых структур из 6-ти субъединиц D, кудачерез домен интегрин I, как в каркас, встраиваются 6 субъединиц I, образуя АТФ-ID комплекс.
Cубъединица H связывается с протопорфирином IX в присутствиимагния, образуя Mg-ПП-CHLH комплекс. Во второй фазе происходит сборкафермента - связывание комплексов АТФ-I-D и Mg-ПП-CHLH через -доменинтегрин I субъединиц D. После встраивания ионов магния в молекулу ППкомплекс становится субстратом для фермента Mg-ПП-метилтрансферазы. Далее,он диссоциирует. После ухода Mg-ПП и при наличии субстрата, субъединицывступают в новый цикл активации (по: Masuda, 2008)42зависит от присутствия АТФ или АДФ. Молекула D-белка также содержитпролин-богатый участок и С-концевой домен интегрин I. Через этот доменпроисходит взаимодействие субъединиц I и D с образованием комплекса АТФ-I-D[Lundqvist, 2010]. Субъединица H формирует комплекс с субстратом, связываяпротопорфирин IX своими концевыми участками. В отсутствии ПП белокподвергается деградации [Sirijovski et al., 2008].
Встраивание ионов Mg2+ вмолекулу протопорфирина IX зависит не только от наличия АТФ, но и отцелостностимембранхлоропластов-функциональныйкомплексМХассоциирован с мембранами через регуляторный белок GUN4 [Adhikari, 2011].Этот фермент проявляет значительное сходство с белками, вовлеченными вбиосинтез двух других класов металлопорфиринов: корриноидов и фактора F430.Все три субъединицы магний-хелатазы ортологичны белкам Ni-хелатазы [Beale,1999]. Помимо выполнения ферментативных функций МХ участвует враспределении молекул ПП по двум биосинтетическим «ветвям». При сниженииее активности, незадействованный ферментом ПП становится субстратом длябиосинтеза гема, который, накапливаясь в избытке, репрессирует активностьGluTR – первого фермента пути биосинтеза порфиринов. Так на метаболическомуровне происходит регулирование количества молекул ХЛ, синтезируемых вклетке.Первые данные о генах, кодирующих магний-хелатазу, появились в связи собнаружением фотосинтетического генного кластера (ФГК) в геномах бактерийRhodobacter capsulatus и Rhodobacter sphaeroides.
Маррс (B.L.Marrs) с соавторами[Yen and Marrs, 1976; Marrs, 1981] установили, что район хромосомы Rhodobactercapsulatus размером 46 кб содержит если не все, то основные гены,контролирующиемагниевуюветвьбиосинтезабактериохлорофиллаикаротиноидов. ФТК включает около 30 открытых рамок считывания (ОРС),которые были клонированы в составе плазмид и использованы для сайтспецифического инсерционного мутагенеза.
Блокирование трех ОРС приводило кпоявлению мутантов, накапливающих протопорфирин IX [Bollivar et al., 1994].43Эти три гена получили названия bchD, bchH и bchI,а кодируемые ими белки BchD, BchH и BchI оказались субъединицами магний-хелатазы, поскольку вэкспериментахinvitroдемонстрировалиферментативнуюактивностьвприсутствии АТФ и ионов магния [Gibson et al., 1995]. Гены, контролирующиесубъединицы магний-хелатазы высших растений, были найдены при изучениибесхлорофильных инсерционных мутантов. У Т-ДНК-мутанта арабидопсиса Ch42(cs), инактивированным оказался ортолог генамалой (I) субъединицы bchIRhodobacter [Koncz et al., 1990], а у мутанта Antirrhinum majus (львиный зев),полученного в результате Tam3-транспозонного мутагенеза, блокированныйвставкой ген olive кодировал белок CHLH большой (H) субъединицы магнийхелатазы [Hadson et al., 1993].Бесхлорофилльные оранжевые мутанты зеленой водоросли Chlamydomonasreinhardii были получены в 70-х годах прошлого века [Столбова, 1971; Wang et al.,1974].
Энди Ванг описал неаллельные мутанты:n brc-1 и brs-1, накапливающиеПП в темноте [Wang et al., 1974]. Один из них – brs-1 был светочувствителен, аbrc-1 – зеленел на свету. На основании таких фенотипов автор выдвинулпредположение о существовании двух различных реакций встраивания Mg2+ вмолекулу ПП, одна из которых происходит на свету, а другая - в темноте. Приэтом мутация brc-1, возможно, блокирует только темновую реакцию, в то времякак brs-1 нарушает оба – световой и темновой пути синтеза ХЛ.
Генетическиеисследования оранжевых мутантов, подобных brc-1 и brs-1, из Петергофскойгенетической коллекции [Столбова, 1971; Квитко и др., 1983], позволилиидентифицировать 2 гена: CHLH и LTS3, мутации в которых ведут к накоплениеПП клетками хламидомонады [Чекунова и Квитко, 1986; Шалыго и др., 1990].Мутации в гене CHLH вызывали гибель клеток при освещении и оказалисьаллельными brs-1, а мутации в гене LTS3 были аллельны brc-1 и приводили кспособности мутантных клеток зеленеть на свету.
Дальнейшие генетикобиохимические исследования показали, что ген CHLH кодирует большуюсубъединицу CHLH магний-хелатазы. К 2001 году его удалось клонировать и44установить молекулярную природу мутаций chl1 и brs-1, - они оказалисьвставками (+1) в экзонах 9 и 10 гена CHLH. В результате, вместо белка размером1399 аминокислот образовывались укороченные полипептиды длиной 479 и 721аминокислот [Chekunova et al., 2001]. Фактор, кодируемый геном LTS3, оказалсярегулятором транскрипции генов, кодирующих магний-хелатазу, - в темноте онактивирует их экспрессию [Чекунова и Савельева, 2010]. Если гены, кодирующиесубъединицы CHLH и CHLD магний-хелатазы у арабидопсиса и хламидомонадыуникальны (представлены в геноме в виде одной копии), то малую субъединицуCHLI у них, соответственно, кодируют два и три гена: CHLI(1-2) и CHLI(1-3), повидимому, появившиеся в результате дупликации [Apchelinov et al., 2007].Субъединица CHLH, а также субстрат и продукт ее функционирования – ПП иMg-ПП, задействованы в пути передачи сигналов из хлоропласта в ядро, повидимому, за счет взаимодействия со связывающим порфирины белком GUN4[Sobotka et al., 2008].
Неспособность к образованию таких комплексов убольшинства известных мутантов по гену CHLH арабидопсиса и хламидомонады:cch (P-642-L), gun5 (A-990-L) и brs-1, ведет к блокированию этого сигнальногопути [Masuda and Fujita, 2008]. Фитогормон абсцизовая кислота (АБК) подавляетметаболизм фотосинтезирующей клетки и играет ключевую роль в адаптациирастений к неблагоприятным условиям среды. Поиски рецепторов АБК уарабидопсиса привели к выделению белка, названного ABAR (abscisic acidreceptor), который оказался молекулойCHLH [Shen et al., 2006]. Эффектасвязывания АБК с H-субъединицей магний-хелатазы ячменя не было установлено[Müller and Hansson, 2009], и участие этого белка в гормональной регуляции ещепредстоит выяснить.
Малая субъединица CHLI магний-хелатазы оказаласьспособной связываться с тиоредоксинами, участвующими в редокс-регуляциибелков хлоропласта [Ikegami et al., 2007]. Недавно появились данные овзаимодействии CHLH и сигма фактора SigE, связывание которых у Synechocystisведет к ингибированию транскрипции SigE-зависимых генов [Osanai et al., 2009].По-видимому, CHLH – ключевой компонент в пути биосинтеза хлорофиллов.45Помимо выполнения ферментативных функций – встраивания Mg2+ в молекулуПП, он участвует впередаче сигналов от хлоропласта к ядру, задействован втранскрипционной регуляции, и является звеном в путях гормонального и редоксконтроля.Биосинтез протохлорофиллида. Метилирование остатка пропионовойкислоты в положении 6 макроцикла Mg-протопорфирина IX, ведет кобразованию его монометилового эфира.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
