Диссертация (1144823), страница 7
Текст из файла (страница 7)
1.9. Комплекс ферментов: глутамил-тРНК-редуктаза (GluTR) темно-серый цвет и глутамат-1-полуальдегидаминотрансфераза (GSA-AT) светло-серый цвет. Модель создана на основе рентгеноструктурного анализабелков: GluTR из M. kandleri и GSA-AM из Synechococcus (по: Lüer et al., 2005).I.3.1.2. Синтез протопорфирина IX из АЛКПри конденсации восьми молекул АЛК образуется первый порфиринпорфобилиноген, который затем, в четыре энзиматических шага, превращается впротопорфирин IX (ПП).
Все имеющиеся данные указывают на абсолютнуюуниверсальность этих биосинтетических реакций как у про- так и у эукариот[Beale, 1999; Timko, 1998]. На этом этапе порфирины становятся гидрофобными ифотореактивными, что делает их опасными для растительной клетки. ПП и егопроизводные – сильные фотосенсибилизаторы, - соединения, способные поддействием света генерировать активные формы кислорода (АФК): синглетныйкислород и (или) перекисные радикалы. Они окисляют липиды, приводя кразрушению клеточных мембран [op den Camp et al., 2003].От АЛК к уропорфириногену III. Порфибилиноген синтетаза (5-АЛКдегидрогеназа, ALAD; реакция 4, рисунок 1.8) из двух молекул АЛК формируетпиррольное кольцо порфобилиногена в присутствии двухвалентных металлов. Урастений и водорослей фермент активируют ионы магния (Mg2+), а у37животных и цианобактерий – ионы цинка (Zn2+).
Порфириноген-дезаминаза(PBGD;реакция5,рисунок1.8)ведетполимеризацию4-хмолекулпорфобилиногена с образованием линейного тетрапиррола гидроксиметилбилана,- субстрата для уропорфириноген III синтетазы (UROS; реакция 6, рисунок 1.8),продуктом которой является макроцикл уропорфириноген III (УРО III) химическая основа всех порфиринов.Ферменты: ALAD, PBGD и UROS локализованы в строме хлоропласта иимеют слабое сродство с мембранами.
Первые работы по клонированиюкодирующих их генов были выполнены на мутантах E.coli K12, неспособныхсинтезироватьгем.Этимутантыотбиралипопризнакудыхательнойнедостаточности (гем входит в состав цитохромов), с последующей проверкойауксотрофности по АЛК и промежуточным субстратам биосинтеза гема[Alefounderet al., 1988]. Гены E.coli: hemB, hemC, HemD, кодирующиевышеперечисленные ферменты, были найдены в результате экспериментов потрансдукции таких мутантов, образующих мелкие колонии, фрагментами ДНК изгеномной библиотеки, и оценке уровня соответствующей ферментативнойактивности у трансдуктантов, формирующих колонии нормального размера.Вскоре гены, контролирующие PBGD, были клонированы и у содержащиххлорофилл организмов: эвглены [Sharif et al., 1989], шпината [Schaumburg et al.,1992], гороха [Witty et al., 2003] и арабидопсиса [Lim et al., 1994].
Ухламидомонады был идентифицирован только ген Alad порфобилиногенсинтетазы [Matters and Beale, 1995]. Гены, контролирующие UROS, клонированыуцианобактерииAnacyistisnidulans[Jonesetal.,1994]иряданефотосинтезирующих организмов. В ядерных геномах хламидомонады иарабидопсиса обнаружены их ортологи.Путь от уропорфириногена III к протопорфирину IX. Превращения УРОIII происходят двумя путями: за счет его последовательного метилирования илидекарбоксилирования.
В ходе метилирования синтезируются фактор F430 и38корриноиды (производные витамина B12). Второй путь ведет к образованию гемаи хлорофиллов, при этом, молекулы протопорфирина IX (ПП) образуются из УРОIII в результате трех ферментативных реакций. Первый фермент этого пути уропорфириногенIII-декарбоксилаза(UROD)конвертируетУРОIIIвкопропорфириноген III (реакция 7, рисунок 1.8).
Затем копропорфириноген IIIоксидаза (CPOX) осуществляет последовательное декарбоксилирование двухостатков пропионовой кислоты боковых цепей колец I и II (при C 3, а затем приС8)довинильныхгрупп[Cavaleiroetal.,1974]собразованиемпротопорфириногена IX (ППГ) (реакция 8, рисунок 1.8). Третий фермент протопорфириногеноксидаза (PPOX) окисляет этот последний бесцветныйпредшественник хлорофилла до красного пигмента протопорфирина IX (реакция9, рисунок 1.8) При наличии молекулярного кислорода это окисление можетпроисходить химически, без участия фермента.UROD из клеток млекопитающих является предметом активного изучениямедицинской генетики.
Нарушения его функциональной активности в результатемутаций в гене Urod обусловливают развитие тяжелых заболеваний - порфирий,наследуемых по аутосомно-доминантному типу [Badminton and Elder, 2005;Brancaleoni et al., 2007]. Наряду с бесхлорофилльными организмами, у которыхUROD кодирует ген hemE, аналогичные гены были клонированы и секвенированыу Synechococcus PCC7942 [Kiel et al., 1992], табака и ячменя [Mock et al., 1995].Следующий фермент - CPOX у большинства фотосинтезирующих эукариоти аэробных прокариот активен только в присутствии кислорода. Способностьнекоторых анаэробных бактерий синтезировать гем и хлорофилл, указывало насуществование иных механизмов образованияпротопорфириногена IX.
Безкислорода эту реакцию могут осуществлять экстракты анаэробной пурпурнойнесерной бактерии Rhodobacter sphaeroides и клеток дрожжей - в присутствииАТФ, окисленных форм пуриновых нуклеотидов и метионина [Tait, 1972; Poulsonand Polglase, 1974]. Изучение механизма окислительного декарбоксилирования уE. coli и S. Typhimurium позволило установить, что аэробную и анаэробную39реакции катализируют различные ферменты, кодируемые негомологичнымигенами hemF и hemN, соответственно [Xu and Elliott, 1993; 1994]. В геномеарабидопсиса имеется последовательность, гомологичная бактериальному генуhemN анаэробного фермента, но не получено доказательств ее функциональнойактивности. Ухламидомонады найден только ген Cpx1 аэробного фермента,гомологичный hemF [Hill and Merchant, 1995].
Гены, кодирующие UROD и CPOX,клонированы и секвенированы у ряда растений, включая сою (Madsen et al., 1993)и табак [Kruse et al., 1995].Дваизоэнзимапротопорфириногеноксидазы(хлоропластныйимитохондриальный) первоначально были найдены в листьях ячменя [Jacobs andJacobs, 1987], а гены, кодирующие этот фермент, впервые были клонированы убактерий: E. coli [Sasarman et al., 1993] и Bacillus subtilis [Hansson and Hederstedt,1994].ИхназвалиhemGиhemY,соответственно.Эторазныегены,контролирующие две ферментные системы. Впервые у растений нуклеотиднаяпоследовательность гена PPOX, кодирующегобылаобнаруженапослесеквенированияпротопорфириногеноксидазу,клонаизбиблиотекикДНКарабидопсиса, который компенсировал эффект мутации ауксотрофности hemG погему у E.
coli [Narita et al., 1996]. Тем же методом геномной комплементации былинайдены 2 гена табака Nicotiana tabacum: PPOX1 и PPOX2. Кодируемые имиферменты оказались локализованы в разных клеточных компартментах – вхлоропласте и митохондриях, соответственно [Lermontova et al., 1997]. Для поискагомологов этого гена у хламидомонады была использована иная стратегия, - когдамутанты по интересующему гену получают как штаммы, устойчивые кингибиторам кодируемого им фермента.PPOX являетсямишенью дляфототоксичных гербицидов габакулина и ацифлюорфена, относящихся к группедифениловых эфиров.
При блокировании фермента гербицидами в растительнойклетке накапливается его субстрат – протопорфириноген IX, который, окисляясьхимически, превращается в фотосенсибилизатор протопорфирин IX. Был полученустойчивый к ацифлюорфену мутант Rs3, у которого доминантная мутация в40ядерном гене нарушала взаимодействие фермента с гербицидом. Фрагментгеномной ДНК размером 10 тпн, содержащий ген устойчивости Rs3, былклонирован и секвенирован [Randolph-Anderson et al., 1998].
Rs3 оказался геномPPX, кодирующим PPOX хламидомонады, точковая мутация G→A в которомобусловливает устойчивость к ацифлюорфену в результате замены V-389-M ваминокислотной последовательности белка.Протопорфирин IX (ПП) - последний общий предшественникгема ихлорофилла, становится субстратом для двух хелатаз, встраивающих в егомолекулу ионы железа (Fe2+) или магния (Mg2+). Несмотря на сходные функции иодин и тот же субстрат - ПП, Mg-хелатаза и Fe-хелатаза - разные по структуре исвойствам ферменты. В условиях in vitro, включение Fe2+ происходитсамопроизвольно и не требует энергии АТФ. Fe-хелатаза представляет собойполипептид длиной от 308 (у Bucillus subtilis) до 466 (у арабидопсиса)аминокислотных остатков, кодируемый геном HemH. У фотосинтетиков ферментлокализован в пластидах и в митохондриях, но основной синтез гема происходитв пластидах [Masuda et al., 2003].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
