Диссертация (Генетический контроль ранних этапов биосинтеза хлорофилла у зелёной водоросли Chlamydomonas reinhardtii), страница 9

Реакцию осуществляет фермент Sаденозил-L-метионин:Mg-протопорфиринIX-метилтрансфераза(Mg-PPMT),используя S-аденозил-L-метионин (SAM), как донор метильных групп (реакция 11,рис.1.8). Циклизация Mg-протопорфирина IX монометилового эфира (Mg-ППМЭ)с образованием дивинил-протохлорофиллида - трехступенчатая реакция,которую ведет Mg-протопорфирин IX-монометиловый эфир окислительнаяциклаза (Mg-PPME) (реакция 12, рисунок 1.8).Ген, кодирующий Mg-PPMT, впервые был найден в геноме R. capsulatusпри инсерционном анализе ФГК, и получил название bchM.

Продукт этого гена вэкстрактах E.coli был способен метилировать Mg-ПП [Gibson et al., 1995]. Егоортолог - chlM вскоре обнаружили у Synechocystis PCC 6803 методомфункциональной комплементации мутанта bchM R. сapsulatus [Smith et al., 1996].Гены,кодирующиеMgPPMTвысшихрастений,удалоськлонироватьсравнительно недавно. В геноме арабидопсиса этот ген – CHLM был найден какгомолог гена chlM Synechocystis sp, - мутант по этому гену, инактивированномувставкой (Т-ДНК), накапливал Mg-ПП и белок CHLH, и демонстрировал высокийуровень репрессии ядерных генов, участвующих в фотосинтезе [Pontier et al.,2007].

Сниженный уровень экспрессии генов коровых белков обеих фотосистем исветособирающего комплекса установлен и для бесхлорофильных мутантовхламидомонады по гену CHLM, которые в темноте накапливали субстратфермента - Mg-ПП и гибли на свету [Meinecke et al., 2010]. Также как и магнийхелатаза, фермент MgPPMT в клетке имеет ―двойную‖ локализацию: в оболочке46хлоропласта и в мембранах тилакоидов в соотношении, близком к 1:30 [Block etal., 2002; Nakayama et al., 1998].

Имеются данные, свидетельствующие о тесномфизическом взаимодействии субъединицы CHLH магний-хелатазы и метилтрансферазы [Alawady et al., 2005]. Эксперименты по определению трехмернойструктуры CHLH показали, что N- и C-концевые участки этой молекулынеобходимы для связывания ПП, а продукт каталитической реакции - Mg-ППподвергается метилированию, оставаясь связанным с CHLH [Sirijovski et al.,2008].Фермент Mg-PPME у растений и водорослей активен только в присутствиикислородаиприсохранениицелостностихлоропластныхмембран.Уфототрофных бактерий его кодирует ген анаэробного фермента bchE [Yang andBauer, 1990].

При мутационном анализе ФГК пурпурной бактерии Rubrivivaxgelatinosus был получен мутант acsF, который накапливал Mg-ППМЭ в условияхаэробного роста, а при анаэробном выращивании не отличался от дикого типа поуровню хлорофиллов [Pinta et al., 2002]. Напротив, мутации в гене bchEприводили к такому фенотипу только в анаэробных условиях или при низкомсодержании О2. Двойной мутант acsF/bchE накапливал Mg-ППМЭ при всехусловиях, демонстрируя, что за аэробную и анаэробную циклизацию Mg-ППМЭотвечают разные гены. Нуклеотидные последовательности этих двух геновоказалась различны, также как и характер их экспрессии: транскрипция гена acsFбыла чувствительной к кислороду, а bchE - не зависела от О2 [Ouchane et al., 2004].Такбылиполученыгенетическиедоказательствасуществованиядвухбиосинтетических путей циклизации Mg-ППМЭ: аэробнного и анаэробного.Ортологи «анаэробного» гена bchE не найдены у зеленых водорослей и высшихрастений.Нуклеотидныепоследовательности,гомологичныегенуAcsFобнаружены у множества организмов - пурпурных бактерий, цианобактерий (заисключением строгого анаэроба Chlorobium tepidum), зеленых водорослей ивысших растений.

В геноме хламидомонады найдено два ортолога гена AcsF:Crd1и Cth1 [Moseley et al., 2000], а у арабидопсиса только один - CHL27 [Tottey et47al., 2003]. Первичная структура продукта гена AcsF позволяет отнести фермент кклассу металлосодержащих монооксигеназ, к которым относятся также аэробныекопропорфириноген- оксидаза (HemF) и рибонуклеотид-редуктаза (NrdB) E.

сoli.Убольшинствафотосинтетиковхлорофиллa(бактериохлорофилл)представляет собой гетерогенную смесь моно- и дивинильных форм молекул,финальная композиция которых зависит от вида, условий роста и стадии развитияорганизма [Rebeiz et al., 1994]. Конверсию 3,8-дивинил-тетрапирролов домоновинильных форм (реакция 13, рис. 1.8) осуществляет продукт гена DVR 3,8-дивинил протохлорофиллид a-8-винилредуктаза [Nagata et al., 2005].I.3.1.4.

Заключительные стадии биосинтеза хлорофилловПоздниеэтапыбиосинтезаХЛвключаютвосстановлениепротохлорофиллида (ПХЛД) до хлорофиллида (ХЛД), и этерификацию егофитолом с образованием хлорофиллов (ХЛ).Превращение ПХЛД в ХЛД катализируют две различные ПХЛДоксидоредуктазы: светозависимая сПОР (Masuda and Takamiya, 2004) исветонезевисимая тПОР [Armstrong, 1998]. Оба фермента функционируют уголосеменных, мхов, лишайников, водорослей и эубактерий, обусловливаяспособность зеленеть как в темноте, так и на свету.

Эволюционно болеемолодые покрытосеменные растения утратили тПОР, и при росте в темнотеони формируют этиолированные ростки (желтые, накапливающие ПХЛД). Светактивирует сПОР, запуская тем самым процесс зеленения - синтез хлорофиллидаи далее хлорофиллов. Хотя оба фермента выполняют одну функцию – редукциюдвойной связи в IV пиррольном кольце макроцикла, они различаются какструктурно, так и по механизму действия.Фотоконверсия протохлорофиллида в хлорофиллид. Ген, кодирующийсПОР, - фотоэнзим НАДФН: ПХЛД-оксидоредуктазу (реакция 14, рисунок 1.8),впервые был клонирован у ячменя [Schulz et al., 1989]. Авторам удалось выделить48фермент из листьев растений в количестве, достаточном для создания антител,которые использовали для изоляции гена POR из кДНК экспрессирующейбиблиотеки методом иммунодетекции.

Позднее, этот ген был найден погомологии у различных растений: пшеницы, овса, гороха, арабидопсиса, сосны, идр. [Reinbothe and Reinbothe, 1996]. История его клонирования у хламидомонадысвязана с желтыми в темноте, зеленеющими на свету мутантами класса yellow.Фенотип такого температуро-чувствительного мутанта y-1-4, неспособногозеленеть на свету при рестриктивной температуре, оказался результатом одноймутации pc-1, приводящей к сдвигу рамки считывания в ядерном гене POR1,кодирующем сПОР [Li and Timko,1996].

Несколько паралогов этого гена: PorA,PorB, PorC найдено в геномах Arabidopsis thaliana [Oosawa et al., 2000], ячменя[Holtorf and Apel, 1996] и некоторых голосеменных [Skinner and Timko, 1999], а вгеномах цианобактерий и хламидомонады – только один ген POR.В 1959 году С. Граник обнаружил, что добавление экзогенной АЛК кэтиолированным проросткам высших растений, растущим в темноте, вызываетнакопление предшественников хлорофилла (от ПП до ПХЛД) [Granick, 1959].Вскоре было установлено, что механизм, в норме препятствующий накоплениюэтих фототоксичных интермедиатов, состоит в обратном ингибировании синтезаАЛК протохлорофиллидом [Timko, 1998].

В 2001 году был обнаружен компонентэтой «регуляторной петли», негативный регулятор биосинтеза порфиринов белокFLU, который через взаимодействие с ферментом GluTR ингибирует синтез АЛК[Meskauskiene et al., 2001]. Мутанты арабидопсиса с нарушенной регуляциейбиосинтеза ХЛ накапливали в темноте избыточное количество ПХЛД и имелиповышенную активность синтезирующих АЛК ферментов. Они были названы flu(fluorescent),из-заярко-краснойфлюоресценцииПХЛДприоблученииэтиолированных проростков синим светом (λ400–450нм), и несли аллельные мутациив ядерном гене FLU. Для его изоляции использовали стратегию позиционногоклонирования и установили, что этот ген кодирует связывающий (binding) белокразмером 316 аминокислот [Meskauskiene and Apel, 2002].

Спустя три года, два49белка, гомологичных FLU, были найдены и у хламидомонады. Эти FLP (Flu-LikeProtein)белкипротяженностью373и386аминокислот–результатальтернативного сплайсинга транскриптов ядерного гена FLP [Falciatore et al.,2005]. Иммунодетекция показала, что они локализованы в мембранах хлоропластаи способны специфически связывать фермент GluTR, ингибируя синтез АЛК.Экспрессия гена FLP позитивно регулируется светом, а в условиях темновогороста – интермедиатами биосинтеза хлорофилла: ПП, Mg-ПП и ПХЛД. Недавнобыло установлено, что у описанного еще в 1974 году [Nielsen, 1974] мутантаячменя tigrina-d, накапливающего ПХЛД в темноте, блокированный мутациейген является ортологом гена FLU арабидопсиса [Lee et al., 2003].Светонезависимый биосинтез хлорофиллида.

Обнаружено три гена,необходимых для редукции ПХЛД в темноте (реакция 17, рисунок 1.8). У Rh.capsulatus они были обозначены как bchB, bchL и bchN, а их ортологи, позднеенайденные в геномах хлоропластов эукариот, получили названия: chlB, chlL иchlN.ЭтигеныкодируюттрисубъединицыферментатПОР(B,L,N),аминокислотные последовательности которых сходны с субъединицами ферментанитрогеназы – NifK, NifH, NifD, соответственно [Armstrong, 1998].Недавно у Rh.

capsulatus был найден еще один, подобный нитрогеназамфермент, участвующий в биосинтезе бактериохлорофилла – хлорофиллид «а»редуктаза COR (chlorophyllide oxydoreductase). Три гена: BchX, BchY, BchZ изфотосинтетического генного кластера бактерии кодируют соответствующиесубъединицы этого фермента [Nomata et al., 2006].Превращение ПХЛД в ХЛД – важнейший этап биосинтеза хлорофилла,который требует более детального рассмотрения. Генетические аспектыисследований ферментов, обеспечивающих этот процесс, подробнее будутизложены в подразделе 1.4.Хлорофилл «а».

Последний этап формирования молекулы хлорофилла - этоэтерификация фитолом -присоединение фитольного «хвоста» к остаткупропионовой кислоты в позиции С17. Фермент, осуществляющий эту реакцию (15,50рисунок 1.8), был выделен из R. capsulatus и назван бактериохлорофиллсинтетазой [Bollivar et al.,1994]. Найден был и ген BchG, кодирующий этотфермент. Впоследствии, в геномах хламидомонады и высших растений былиобнаружены его ортологи – СhlG [Garcia-Gil et al., 2003]. Фитол –мононенасыщенный спирт (С20Н39ОН) - синтезируется из геранилгеранилдифосфата (ГГ-ДФ), который подвергается редукции ферментом геранилгеранилредуктазой с образованием фитил-дифосфата (фитил-ДФ). Он кодируется генами:bchP/chlP (у бактерий и эукариот, соответственно) и участвует, также, вбиосинтезе каротиноидов.