Диссертация (Генетический контроль ранних этапов биосинтеза хлорофилла у зелёной водоросли Chlamydomonas reinhardtii), страница 10

Хлорофилл синтетаза в качестве субстрата можетиспользовать оба изопрена: фитил-ДФ и ГГ-ДФ.На тилакоидных мембранах хлоропластов световая энергия адсорбируетсяпигмент-белковыми светособирающими комплексами (ССК) двух фотосистем.Типичный апопротеин ССКII связывает 17 молекул пигментов, из которых 3 –каротиноиды (ксантофилы) и 14 молекул хлорофиллов (8 – ХЛа и 6 – ХЛb).Хлорофилл b (ХЛb) - дополнительный пигмент растений, водорослей ипрохлорофит, доля которого составляет 15-50% от общего содержанияхлорофиллов.Хлорофилл «b».

В процессе биосинтеза хлорофилла b происходитпоследовательное двухступенчатое окисление метильной группы в положении 7макроцикладоформильной.Реакциюкатализируетферментхлорофиллид/хлорофилл оксигеназа (CAO) в присутствии кислорода. Субстратомдля него может служить как хлорофиллид «а» так и ХЛа.Мутанты без ХЛb были впервые получены на арабидопсисе в 1963 году[Hirono and Redei, 1963]. Позднее, они были найдены у многих других высшихрастений, включая ячмень, кукурузу и рис. Генетический анализ десяти подобныхмутантов ячменя показал, чток утрате ХЛb ведут мутации из одной группыкомплементации, свидетельствуя, что синтез ХЛb контролируется однимгенетическим локусом [Simpson et al., 1985]. Первый мутант хламидомонады без51ХЛb был описан в 1976 году [Ладыгин, 1976], а после получения коллекция такихмутантов удалось установить, что отсутствие ХЛb обусловлено рецессивнымимутациями в ядерном гене Cbn1[Мирная и др., 1990].

Этот ген, позднееполучивший название CAO (chlorophyll «a» oxygease) (реакция 16, рис.1.8), былклонирован с помощью инсерционных мутантов без ХЛb хламидомонады [Tanakaet al., 1998]. В дальнейшем, его нуклеотидную последовательность использовалидля поиска гомологичных генов в геномных и кДНК библиотеках арабидопсиса идругих высших растений.Синтез хлорофилла b в растительной клетке регулируется на уровнетранскрипции гена CAO и посттрансляционно. Молекула фермента CAOвключает три домена: А, В и С, при этом, каталитическую функцию выполняетдомен С. Трансгенные растения, экспрессирующие белок САО без N-концевогоА-домена накапливали ХЛb и гибли от обесцвечивания на свету [Yamasato et al.,2008]. Авторы предположили, что А-домен участвует в контроле биосинтеза ХЛ инеобходим для защиты от фотодеструкции.1.4.

Превращения протохлорофиллида: темновой и светозависимый путиФототрофные бактерии и пластиды водорослей и растений содержаттетрапиррольные пигменты  бактериохлорофиллы (БХЛ) и хлорофиллы (ХЛ),обеспечивающие процессыфотосинтеза[Шестаков, 1998].Аноксигенныебактерии синтезируют их в темноте, цианобактерии - на свету и в темноте, апокрытосеменные растения – только на свету. Способность к светонезависимомуи (или) светозависимому образованию ХЛ или БХЛ обеспечивается ферментами,катализирующими превращение протохлорофиллида (ПХЛД) в хлорофиллид(ХЛД). В эволюции сформировалось два пути осуществления этой реакции. Одиниз них обеспечиваетсяферментом тПОР - независимой от света, или темновойпротохлорофиллид-оксидоредуктазой.Всвоюочередь,светозависимоеобразование ХЛД осуществляет НАДФН: протохлорофиллид оксидоредуктаза52сПОР.

Ниже представлены результаты генетических, молекулярно-биологическихи биохимических исследований этих двух ПХЛД-оксидоредуктаз. Обсуждаютсяэволюционные аспекты их происхождения и функционирования. Основноевнимание уделено генетике наиболее древнего темнового биосинтеза ХЛ.I.4.1. Протохлорофиллид в цепи биосинтеа хлорофилловПротохлорофиллид(ПХЛД)последнийобщийбиосинтетическийпредшественник ХЛ и БХЛ, двух структурно родственных пигментов, которыеразличаются, в частности, природой боковых цепей при атомах углеродатетрапиррольного макроцикла (рисунок 1.11). Они поглощают свет и участвуют вразделении зарядов поперек энергосопрягающих биомембран, что являетсяосновой аноксигенной фототрофии у бактерий, синтезирующих БХЛ, иоксигенной фототрофии у цианобактерий, прохлорофитов, водорослей и высшихрастений.

In vivo, ХЛ и БХЛ – это хромофоры пигмент-белковых комплексовсветособирающихантенниреакционныхцентров,расположенныхнафотосинтетических мембранах [Пиневич, Аверина, 2002].Биосинтез тетрапирролов у фототрофных организмов осуществляется черезцепочку биохимических реакций, катализируемых как растворимыми, так имембраносвязаннымиферментами.Путьпревращениятетрапиррольногомакроцикла протопорфирина IX (ПП), последнего общего биосинтетическогопредшественника ХЛ и гема, в Mg-протопорфирин IX и далее через рядпредшественников, в ХЛ или БХЛ, известный как магниевая ветвь биосинтезатетрапирролов, характерен для всех фототрофных организмов [Reinbothe,Reinbothe, 1996].

Мишенью световой регуляции этого пути служит ПХЛД(рисунок 1.12). В клетке пигмент существует в двух формах: дивинил-ПХЛД имоновинил-ПХЛД, соотношение которых варьирует у разных организмов изависитотвнешнихусловийистадиионтогенеза.Биологическаяцелесообразность гетерогенности этих молекул до сих пор не ясна [Беляева,2009].53Рисунок 1.11. Синтез хлорофилла и бактериохлорофилла изпротохлорофиллида (ПХЛД). У аноксигенной бактерии R.

Capsulatus циклическийтетрапиррол ПХЛД превращается в ХЛД ферментом тПОР в результатевосстановления двойной связи в положении С17–С18 в кольце D макроцикла,состоящим из трех субъединиц: BchLNB. Далее комплекс ХЛД-оксидоредуктазыBchXYZ, восстанавливает двойную связь в кольце B (C7–C8) с образованиембактериохлорофиллида, из которого синтезируется БХЛ а.

Из ХЛДа у оксигенныхфотосинтетиков после присоединения фитола образуется ХЛа. В скобках указанымаксимумы в спектрах поглощения пигментовПХЛД  субстрат реакции, которая заключается в восстановлении двойнойсвязи в четвертом кольце молекулы в положении C17C18 (рисунок. 1.11). Этареакция может проходить в темноте и на свету. Светозависимое восстановлениеПХЛД свойственно оксигенным фототрофам. Темновой и светозависимыйбиосинтез ХЛ сосуществуют у многих организмов, в том числе цианобактерий,водорослей и голосеменных растений.

Покрытосеменные растения не образуют54ХЛ в темноте. Эта способность утеряна и унекоторыхголосеменных(листопадноедерево Ginkgo biloba, тропическая лианаGnetumиulaрастущаяWelwitschiamirabilis),папоротникаPsilotumводорослиEuglenaводоросливапустыняхтакжеуnudum,зеленойикраснойgracilisCyanidiumcaldarum.Большинство аноксигенных фототрофов,включая пурпурные и зеленые бактерии,образуют БХЛ только в темноте [Armstrong,1998]. У организмов, синтезирующих ХЛ вРисунок 1.12.

Схема регуляциибиосинтеза ХЛ. Пигмент образуетсяиз глутамата через сериюферментативных реакций (стрелки).АЛК - 5-аминолевулиновая кислота.Фигурная стрелка - механизмрегуляции: протохлорофиллид черезбелок FLU репрессирует ферментGluTR-глутамат-тРНК-редуктазу.темноте, качественные и количественныехарактеристикиварьируютвэтогопроцессазависимостиотсильностадииразвития и внешних условий. Активныйтемновой биосинтез ХЛ, характерный длявзрослыхголосеменныхзначительносниженуихрастений,проростков(Wettstein et al., 1995).

Первичные иголочки секвойи (Metasequoia glyptostroboides)и вторичные иголочки европейской пинии (Pinus pinea) сохранили способностьзеленеть в темноте [Laudi and Manzini, 1975; Ou, Adamson, 1995], тогда какпроростки некоторых видов лиственниц, например Larix decidua, ее практическиутратили [Mariani et al., 1990].I.4.2. Биосинтез хлорофиллов в темноте. Генетические исследованияДоказательства существования двух путей восстановления ПХЛД:желтые в темноте (yellow) мутанты зеленых водорослей.

Предположение оналичии нескольких механизмов, обеспечивающих восстановление ПХЛД в55процессе биосинтеза ХЛ, было высказано еще в начале 50-х годов XX века приизучении зеленых водорослей. Классический генетический анализ выявилобширный класс так называемых желтых (yellow) мутантов с нарушеннымтемновым синтезом ХЛ, которые имели желтую окраску при выращивании втемноте, но на свету зеленели подобно этиолированным проросткам высшихрастений. Их пигментация в темноте обусловлена отсутствием ХЛ, накоплениемПХЛД и наличием желтых каротиноидов.

Мутанты yellow были получены у рядазеленых водорослей, включая Chlorella, Scenedesmus [Bogorad, 1976] иChlamydomonas reinhardtii. В ядерном геноме последней найдено 8 локусов,мутации в которых вызывают появление фенотипа yellow [Sager, 1955; Ford andWang, 1980; 1980a; Zhang, 2007].