Диссертация (Генетический контроль ранних этапов биосинтеза хлорофилла у зелёной водоросли Chlamydomonas reinhardtii), страница 2

Важнейшая фундаментальная проблема современнойбиологической науки состоит в изучении природы процессов биосинтеза ХЛ,механизмов его генетической и биохимической регуляции и закономерностейизменений, которые они претерпели в ходе эволюции и при адаптации кразличным источникам и формам освещения.

Темой настоящего исследованиясталимолекулярно-генетическиемеханизмы,обеспечивающиерегуляциюпроцессов хлорофиллобразования. Основное внимание уделено практически неисследованной области - генетике темновых процессов ранних этапов биосинтезахлорофилла.Обьект изучения ˗ зеленая одноклеточная эукариотическая водоросльхламидомонада Chlamydomonas (С) reinhardtii (рисунок 1).

Этот микроорганизм,интенсивно используемый в экспериментальных исследованиях генетическогоконтроля процессов фотосинтеза, является модельным биологическим объектом,совмещающим в себе особенности генетических систем про- и эукариот [Rochaix,1995; Harris, 1989]. C. reinhardtii относят к зелѐным водорослям (Chlorophyta)порядка Volvoxcales семейства Chlamydomonacea.

Она способна к трѐм типампитания: фототрофному, миксотрофному и гетеротрофному. В отличие от высших8растений, формирование фотосинтетических мембран хлоропласта и синтезхлорофилла в клетках хламидомонады происходит не только на свету, но и втемноте, - за счѐт утилизации источников углерода из питательной среды.Успешное использованиеC. reinhardtiiв качестве модельногообъектагенетических исследований обусловлено такими особенностями ее биологии, какналичие полового размножения, короткий гаплофазный жизненный цикл ипростота культивирования. Для C. reinhardtii разработаны методы молекулярногенетического, геномного и протеомного анализов.

Клетка этой водоросли имееттри полуавтономных генома: ядерный, включающий 17 групп сцепления,хлоропластный и митохондриальный. Все они секвенированы и доступны дляанализа. Существует несколько кДНК и геномных библиотек C.reinhardtii,включая библиотеку BAC-клонов.На кафедре генетики и селекции биолого-почвенногофакультета СПбГУ была создана уникальная генетическаяколлекцияпигментныхмутантовхламидомонады[Столбова, 1971], которая положила начало исследованиямгенетическогоРисунок 1. КлеткаC.reinhardtii (1000x).контроляметаболизмапигментовхлоропласта – хлорофиллов и каротиноидов.Актуальность темы исследования и степень ее разработанности.Биосинтез хлорофиллов у растений и водорослей происходит в хлоропласте(рисунок 2). Большинство белков, вовлеченных в этот процесс, кодируютсяядром, синтезируются в цитоплазме, и транспортируются в хлоропласт.

Дляоптимизации взаимодействий хлоропласта и ядра при реализации функцийфотосинтеза клетка осуществляет координированный контроль экспрессииядерных генов в ответ на метаболические сигналы хлоропласта (активные формыкислорода,сахара,интермедиатысинтезахлорофилла,редокс-активныемолекулы) и факторы внешней среды. Молекулы хлорофиллов (ХЛ) относятся к9Рисунок 2. Биосинтез тетрапиррололов в растительной клетке ипути его регуляции (www.southampton.ac.uk, Matthew Terry). ALA– АЛК; PФВ – порфобилиноген.классу природных тетрапирролов, общий путь биосинтеза которых включаетследующие основные шаги: (1) синтез 5-аминолевулиновой кислоты (АЛК); (2)образование из АЛК уропорфириногена III (УроIII); (3) синтез протопорфиринаIX (ПП) из УроIII; (4) превращение ПП в протохлорофиллид (ПХЛД); (5)формирование хлорофилла из ПХЛД.

У всех биологических объектов ˗ отдревнейших микроорганизмов до человека ˗ биосинтез тетрапирролов начинаетсяс образования 5-аминолевулиновой кислоты (АЛК). В фотосинтезирующей клеткемолекулы АЛК не только служат предшественником хлорофилла, но и являютсярегуляторами роста растений и задействованы в синтезе аминокислоты пролина.Первый циклический тетрапиррол уропорфириноген III дает начало двумбиосинтетическим ветвям, одна из которых завершается формированием сирогемаи корриноидов, а вторая - протопорфирина IX (ПП), который, в свою очередь,является общим предшественником двух путей биосинтеза. Встраивание катионажелеза Fe2+ в молекулу ПП ведет к образованию протогема, гема и ряданелинейных тетрапирролов, включая фитохромобилин.

Специфичные реакцииформирования хлорофилла - «магниевая ветвь» тетрапиррольного биосинтеза.10Они начинаются со встраивания ионов Mg2+ в структуру протопорфирина IX изавершаются образованием молекул пигмента. Их можно разделить на два блока:(I)Ранниеосуществляемыеэтапытремябиосинтезаферментами:–этореакции,магний-хелатазапоследовательно(МХ),Mg-ПП-метилтрансфераза и Mg-ПП-монометиловый эфир циклаза, приводящие кформированию протохлорофиллида (ПХЛД) из протопорфирина IX.

Они нетребуют света и проходят одинаково у всех фотосинтезирующих организмов, какпро- так и эукариот. Первый специфический фермент биосинтеза ХЛ – магнийхелатаза (МХ) обеспечивает превращение ПП в магний-протопорфирин IX (MgПП), и представляет собой комплекс, состоящий из трех субъединиц: CHLI,CHLD и CHLH, кодируемых генами: CHLI, CHLD и CHLH, соответственно.Помимо выполнения ферментативных функций, большая CHLH субъединица МХзадействована в регуляторных процессах – передаче сигналов от хлоропласта кядру и в путях гормонального и редокс-контроля [Юрина и др., 2012; Masuda,2008].

Метилирование Mg-ПП и формирование циклопентанонового кольцазавершаютсяпоследовательнымобразованиемпротохлорофиллида.Гены,кодирующие субъединицы магний-хелатазы, впервые были идентифицированы вгеноме бактерии Rhodobacter capsulatus [Bollivar et al., 1994]. У высших растенийих ортологи: ген CHLI и ген CHLH (olive), были найдены при изучениибесхлорофильных мутантов арабидопсиса Ch42 [Koncz et al., 1990] и львиногозева Antirrhinum majus [Hadson et al., 1993], соответственно. Важная роль белкаCHLH в функционировании и регуляции системы биосинтеза ХЛ делала в высшейстепени актуальной задачу идентификации кодирующего его гена у зеленыхводорослей, к которым относится C.

reinhardtii.(II) Завершающие этапы биосинтеза – конверсия протохлорофиллида(ПХЛД) до хлорофилла, осуществляются по-разному у высших растений иэволюционно более древних фотосинтетиков: голосеменных, мхов, лишайников,водорослей, эубактерий. У покрытосеменных растений этот процесс возможен11только на свету, а у остальных классов фотосинтезирующих организмов оносуществляется как на свету, так и в темноте.Несмотря на хорошую изученность ферментативного аппарата биосинтезаХЛ [Миронов, 1998; Beale, 1999; Шестаков, 1998], ряд вопросов в генетике этогопроцесса остаются открытыми до сих пор. Практически не исследованымеханизмы регуляции его темновых реакций.

До недавнего времени полагали, чтоспособность растений и фототрофных микроорганизмов синтезировать ХЛ насвету и в темноте зависит только от наличия двух ферментных систем,обеспечивающихпревращениеПХЛДвхлорофиллид(рисунок3).Светозависимый катализ осуществляет кодируемая ядром НАДФH: ПХЛДоксидоредуктаза (сПОР). Темновую реакцию катализирует ферментный комплекстПОР, субъединицы которого кодируют 3 гена хлоропласта: chlB,chlN и chlL,ведущие свое происхождение от нитрогеназ эубактерий [Armstrong, 1998;Чекунова, 2010]. В процессе эволюции высшие растения утратили тПОР, а болеедревние фотосинтетики, к числу которых принадлежит одноклеточная зеленаяводоросль C.

reinhardtii, сохранили способность синтезировать ХЛ в темноте,используя в качестве источника углерода ацетат натрия. Реакции заключительнойстадии биосинтеза ХЛ в последние двадцать лет интенсивно исследуются[Беляева, 2010]. При этом, генетическая регуляция ранних светонезависимыхэтапов биосинтеза ХЛ оставалась до последнего времени неизвестной.У зеленых водорослей Chlamydomonas, Chlorella и Scenedesmus былиизолированы и изучены десятки мутантов с нарушениями темновой конверсиипротохлорофиллида – неспособные зеленеть в темноте [Александрова, 1979;Квитко, 1983; Timko, 1998]. Все они относятся к одному фенотипическому классу,называемому «yellow». В темноте их клетки, подобно этиолированнымпроросткампокрытосеменныхрастений,несинтезируютхлорофилл,накапливают ПХЛД, и, благодаря присутствию каротиноидов, формируютколонии желтого цвета, зеленеющие на свету.