Диссертация (Генетический контроль ранних этапов биосинтеза хлорофилла у зелёной водоросли Chlamydomonas reinhardtii), страница 5

Хлорофиллы группы с - c1, с2 и c3 (формула II, рис. 2.3) вотличие отдругих форм содержат негидрированный порфириновый макроцикл и остатокнеэтерифицированной акриловой кислоты. У морских водорослей они в составебелковых комплексов функционируют как светособирающие антенны. У бурыхводорослей,диатомовыхводорослейидинофлагеллятвместоХЛbфункционирует ХЛс, а у багрянок - ХЛd (табл. 1.1). Пятый тип хлорофиллов,названный ХЛf, был недавно обнаружен в цианобактериях, обитающих на скалахзападного побережья Австралии [Chen et al., 2010]. Хлорофилл f поглощает болеедлинноволновый свет, чем его четыре «брата-близнеца» - в красной иРисунок 1.3. Структурные формулы хлорофиллов24инфракрасной областях спектра (706 нм), и позволяет расширить спектральныйдиапозон, усваиваемый фотосинтетизирующими организмами (рисунок 1.5)..1234ХЛa: R = СН — СН2, R = СН3, R = С2Н5, R = ХЛc1: Rl = CH3, R2 = C2H5CH2CH2C(0)YХЛс2: R1= CH3, R2 = CH = CH21234ХЛb: R = СН = СН2, R = СНО, R = C2H5, RХЛd: R1 = СНО, R2 = СН3, R3 = С2Н5, R4ХЛ с3: R1 = СООСН3, R2 = CH=CH2Рисунок 1.4.

Структурные формулы хлорофиллов: ХЛа, ХЛb, ХЛd (I), иХЛс1-с3(II)АБРисунок 1.5. Сравнительные характеристики структуры (А) и спектрапоглощения (Б) хлорофилла f (по: Chen et al., 2010)Эубактерии, осуществляющие бескислородный фотосинтез (пурпурные изеленыебактерии,гелиобактерии)содержатособыеХЛ,называемыебактериохлорофиллами (БХЛ). Они имеют восстановленную двойную связь во25втором (B) кольце макроцикла и различаются природой и порядком чередованиябоковыхзаместителей.Идентифицировано6основныхвидовбактериохлорофиллов: а, b, с, d, e и g. Бактериохлорофиллы а, b и с существуют внескольких модификациях, так как радикал R4 может быть фитолом, фарнезолом,геранил-гераниолом или другим многоатомным спиртом. В основе БХЛ a, b и gлежит тетрагидропорфириновый макроцикл (рисунок 1.6, ф-ла III), длябактериохлорофиллов с, d и е, первоначально называемых хлоробиумхлорофиллами,характерноналичиедигидропорфириновогомакроцикла,гидроксиэтильной группы в положении 3 и различных алкильных (от С 1 до С5)заместителей в положении 8; эфирные группы (Y) – представляют собой остатки2,6-фитадиенола (рисунок 1.6, ф-ла IV).БХЛ a: R1 = СОСН3, R2 = СН3, R3 = С2Н5, R4 = CH2CH2C(0)Y, R5 = НБХЛ b: R1 = СОСН3, R2 = СН3, R3 + R5= (=СНСН3), R4 = CH2CH2C(O)YБХЛ g: R1 = СН = СН2, R2 = CH3, R3+ R5 = (= CHCH3), R4 = CH2CH2C(O)YБХЛ с: R1 = СН3, R2 = С2Н5, R3 = СН3, R4 = CH2CH2C(O)Y, R5 = СН3БХЛd: R1 =CH3, R2 = C2H5-C5H11, R3= C2H5, R4 = CH2CH2C(O)Y, R5 = HБХЛ e: R1 = CHO, R2 = C2H5-C5H11, R3 = C2H5, R4 = CH2CH2C(O)Y, R5 = CH3Рисунок 1.6.

Структура бактериохлорофиллов (БХЛ). Из пурпурных бактерийвыделены БХЛа и b, из зеленых бактерий - БХЛа, с, d и е, из серных бактерий - БХЛс, dи е; обнаружены также фотосинтезирующие бактерии, содержащие БХЛgВсепурпурныебактериисодержаткакую-либооднуформубактериохлорофилла: а или b. Небольшие различия в химическом строенииприводят к существенным изменениям в спектральных свойствах этих пигментов.Пурпурные бактерии, содержащие бактериохлорофилл а, могут поглощать свет с26длиной волны до 900 нм. У видов, имеющих бактериохлорофилл b, максимумпоглощения в красной части спектра сдвинут в длинноволновую область болеечем на 100 нм.

Дальше бактериохлорофилла b не поглощает ни один из известныхфотосинтетических пигментов (рисунок 1.7; таблица 1.1). Основными пигментамизеленых бактерий являются бактериохлорофиллы с, d или е, незначительноразличающиеся между собой по спектрам поглощения (таблица 1.1).

Кроме них вклеткахвсехзеленыхбактерийвнебольшомколичествесодержитсябактериохлорофилл а. Наличие этих бактериохлорофиллов позволяет зеленымбактериям использовать свет с длиной волны до 840 нм. Необычныйбактериохлорофилл g с максимумом поглощения 790 нм обнаружен у облигатноанаэробных фотосинтезирующих бактерий Heliobacterium chlorum и Heliobacillusmobilis, выделенных в группу гелиобактерий [Пиневич, Аверина, 2002].Таблица1.1.Светопоглощение.Характеристикихлорофилловибактериохлорофиллов*Химическая природарадикала R4Природный источникМаксимум поглощенияв клетке (нм)aФитолВсе аэробные организмы680-685bс1с3dfфитол650-660фитолфитолЗеленые водоросли и растенияБурые, диатомовые водоросли,динофлаггелятыБагрянки, цианобактерииЦианобактерииaфитол или ГГПурпурные бактерии830-890bфитол или ГГПурпурные бактерии1020-1030cфитол, фарнезол и др.Зеленые и бурые бактерии750-760deфарнезол-Зеленые и бурые бактерииЗеленые и бурые бактерии720-740710-720БактериохлорофиллХлорофиллПигментgфитолок.

640710706-720Гелиобактерии770-790*Фитол — С20Н39ОН; фарнезол — С15Н25ОН; геранил-гераниол— С20Н33ОН.27Рисунок 1.7. Спектры поглощения хлорофиллов и бактериохлорофиллов. ХЛа– черный, ХЛб – красный, БХЛа – малиновый, БХЛб – оранжевый, БХЛс - цветморской волны, БХЛd– синий, БХЛe–зеленый (по: Frigaard, et al., 1996)1.3. Генетика биосинтеза хлорофиллов. Достижения и проблемыНачало генетике пигментов растений было положено опытами ГрегораМенделя по изучению характера наследования факторов, определяющих желтуюокраску семян и проростков гороха [Mendel, 1885].

Этот «менделевский» генудалось найти только спустя 140 лет - им оказался ген Sgr (stay green),кодирующий один из белков, необходимых для деградации хлорофилла [Armsteadat al., 2007].Всередине20векаважнойвехойвисследованияхбиосинтезахлоропластных пигментов стали работы Самуэля Граника (Sam Granik), которыйобнаружил,чтопротопорфиринбесхлорофильныеIX(ПП)–мутантыбиосинтетическийхлореллынакапливалипредшественникгема[Granick,1950]. Так было установлено, что гем и ХЛ имеют общий путьбиосинтеза. Генетический контроль синтеза гема у E.coli изучал Сесерман (ASặsặrman) [Săsărman et al., 1968]. В его лаборатории были найдены гены, мутациив которых приводили к дыхательной недостаточности, и показано, что эти геныконтролируют ферменты пути биосинтеза гема, начиная от универсальногопредшественника всех тетрапирролов - 5-аминолевулиновой кислоты (АЛК) доПП - последнего общего интермедиата в биосинтезе ХЛ и гема (рисунок .1.8).28Мутантные штаммы E. Coli с дефектами отдельных шагов биосинтезатетрапирролов в дальнейшем послужили основой для поиска гомологичных генову других видов.Cобытием в генетике биосинтеза ХЛ стало обнаружение в геномепурпурной несерной бактерии Rhodobacter capsulatus фотосинтетическогогенного кластера (ФГК) - участка хромосомы размером около 45 тпн,содержищего близко-сцепленные гены структурных белков аппарата фотосинтезаи всех ферментов биосинтеза каротиноидов и бактериохлорофилла а [Zsebo andHearst,1984].СеквенированиеФГКиэкспериментыпонаправленнойинактивации открытых рамок считывания (ОРС) с последующей проверкоймутантногофенотипапозволиливпервыеполучитьнуклеотидныепоследовательности генов, контролирующих специфические реакции синтеза ХЛ.В дальнейшем, ортологи этих генов были найдены у растений и водорослей.Для клонирования генов высших растений, кодирующих все 16 ферментовбиосинтеза ХЛ (рисунок 1.8; таблица 1.2) потребовалось около 20 лет.

В 1989году была опубликована нуклеотидная последовательность гена POR ячменя[Schulz et al., 1989], а через 17 лет удалось прочитать последний в этом ряду генарабидопсиса DVR, кодирующий фермент, превращающий дивинильные формыХЛа в моновинильные [Nagata et al., 2005].Несмотря на хорошую изученность ферментативного аппарата биосинтезахлорофилла [Миронов, 1998; Beale, 1999; Шестаков, 1998], ряд вопросов вгенетике этого процесса остаются открытыми до сих пор. Некоторые этапыбиосинтеза (рисунок 1.8, реакции: 8, 9 и 12) у водорослей и растений требуютналичиякислорода.Вместестем,многиебактериисинтезируютбактериохлорофилл в отсутствие О2.

Такие анаэробные ферменты и кодирующиеих гены найдены далеко не во всех известных случаях. Мало исследованы имеханизмы формирования ХЛ в темноте. Хотя у покрытосеменных растенийобразованиеэтогопигмента–светозависимыйпроцесс,большинствофотосинтезирующих организмов (в том числе голосеменные, мхи, водоросли и29фототрофные бактерии) способны зеленеть и в темноте. Они содержатальтернативные фотоэнзиму сПОР (POR, реакция 14, рисунок 1.8) ферментныйкомплекс тПОР (DPOR), кодируемый у эукариот хлоропластными генами,который ведет превращение протохлорофиллида (ПХЛД) в хлорофиллид (ХЛД) втемноте. При этом, у водоросли Chlamydomonas reinhardtii известны мутанты поядерным генам (yellow1-10 и lts3) с нарушениями независимого от света синтезаХЛ [Timko, 1998; Шалыго и др., 1990].

Идентификация этих генов открываетвозможности исследования еще неизвестных факторов, необходимых длятемновых реакций биосинтеза ХЛ. В настоящее время активно ведется и поискгенетическихдетерминантов,обеспечивающихрегуляциюметаболизмапигментов и связанных с ним процессов биогенеза хлоропластов [Masuda andFujita, 2008]. Значительный вклад в решение этой проблемы внесли исследованиямутантов с нарушенной регуляцией хлорофиллобразования таких модельныхобъектов генетики фотосинтеза, как арабидопсис (Arabidopsis thalianum), зеленаяводоросль хламидомонада (Chlamydomonas reinhardtii) и бактерии Rhodobactercupsulatus и Synechocystis sp.

PCC. С накоплением экспериментальных данныхстановиться все более очевидным, что ферменты и интермедиаты метаболизмаХЛ являются участниками регуляторных процессов, обеспечивающих системныйконтроль, - сложный аппарат факторов и сигналов, необходимых дляоптимальнойработыгенетическихмеханизмовизменяющихся условиях ее существования.растительнойклеткив30Рисунок 1.8. Схема биосинтеза хлорофилла.