Диссертация (Генетический контроль ранних этапов биосинтеза хлорофилла у зелёной водоросли Chlamydomonas reinhardtii), страница 14

Онаотносится к семейству дегидрогеназ/редуктаз короткоцепочечных спиртов и также,кактПОР,имеетпрокариотноепроисхождение.Основываясьнафилогенетическом анализе и характере распределения тПОР и сПОР средифототрофных организмов, можно предположить, что присущая аноксигеннымбактериям тПОР – более архаичная ферментная система, имеющая общеепроисхождение с нитрогеназой. В процессе эволюции сПОР, по-видимому,появилась вместе с оксигенной фототрофией в ответ на увеличение содержанияO2 в атмосфере, что компенсировало потерю активности чувствительной ккислороду тПОР [Schoefs and Franck, 2003; Fujita et al., 2006].72Какими причинами было обусловлено появление светозависимого аппаратабиосинтеза ХЛ? Какова цена утраты комплекса тПОР покрытосеменнымирастениями? Исчерпывающие ответы на эти вопросы еще не получены.

БиоинтезБХЛ у современных анаэробных бактерий ингибируется светом и кислородом[Shiba and Shimada, 1997]. Такое ингибирование можно рассматривать какмеханизм предотвращения потенциальной опасности фотоокисления [Шалыго,2004].Молекулыпорфиринов,ккоторымотносятсяБХЛ,ХЛиихбиосинтетические предшественники,  сильные фотосенсибилизаторы, на светувызывающие образование синглетного кислорода.

В аэробных условияхингибирование тПОР светом и кислородом может снижать эфективностьфотосинтеза и приводить к накоплению ПХЛД [Fujita and Bauer, 2000]. ПоявлениесПОР предотвращало этот процесс и обеспечивало эффективный оксигенныйфотосинтез.Организмы,способныекобоимтипамбиосинтезаХЛ(БХЛ)-светозависимому и темновому, выбирают пути восстановления ПХЛД взависимостиотинтенсивностиосвещенияисодержаниякислорода.Цианобактерия P. borianum на слабом свету (интенсивностью менее 1025мкмоль квантовм2с1) образует ХЛ только с помощью тПОР; при освещенностисвыше 130 мкмоль квантовм2с1весь ХЛ синтезируется исключительно спомощью сПОР, а при средней интенсивности света (25130 мкмольквантовм2с11)функционируютобафермента,ибольшаячастьХЛобразовывалась по светозависимому пути (Fujita et al., 1998).

Мутант, лишенныйсПОР, терял способность расти в аэробных условиях и при высокойинтенсивности света. Его перенесение в анаэробные условия приводило квозобновлению роста и биосинтеза ХЛ [Yamazaki et al., 2006]. Все эти данныесвидетельствуют о том, что тПОР и сПОР компенсируют функции друг друга взависимости от состояния окружающей среды, позволяя организмам выживатьпри изменении освещенности и содержания кислорода.73ДляаэробныхфотосинтетиковсПОРимеетнесколькоочевидныхпреимуществ перед тПОР:-фермент нечувстсвителен к кислороду;-как фотоэнзим, он лимитирует накопление фотосенсибилизатораПХЛД, предотвращая процессы фотодеструкции;-скорость восстановления ПХЛД с помощью сПОР значительно выше,чем в случае тПОР, что обеспечивает высокую продуктивность биосинтеза ХЛ.По-видимому,этипреимуществасталипричинойпереходапокрытосеменных растений к светозависимому синтезу ХЛ в условияхоксигенного фотосинтеза, что сопровождалось потерей генов, кодирующих тПОР.Для адаптации к разным условиям освещения некоторые растения, напримерарабидопсис, взамен утраченной тПОР обзавелись несколькими гомологичнымигенами сПОР (PORA, PORB и PORC), экспрессия которых по-разному зависит отсвета и наличия НАДФ(Н) [Kim and Apel, 2004].

Следует отметить, что свет икислород оказывают критическое влияние на жизнь фотосинтезирующихорганизмови,по-видимому,являютсяосновнымифакторамиэволюциифототрофов, которая шла в направлении адаптации к этим изменяющимсяпараметрам внешней среды. Более архаичный темновой биосинтез ХЛсформировался в анаэробных условиях, а затем эволюция ХЛ-синтезирующихорганизмов шла по пути адаптпции к увеличению интенсивности света (припереходе из воды на сушу) и содержания кислорода.В то время как сПОР изучена довольно подробно [Беляева, 2009],современные знания о темновом биосинтезе ХЛ, так же, как и сведения омеханизмах адаптации растительной клетки к свету крайне немногочисленны.

Вкультурах штаммов хламидомонады, растущих на свету, мутации yellowспонтанновозникаютсвысокойчастотой(103104).По-видимому,вфототрофных условиях потеря тПОР дает селективное преимущество, и наличиеядерных генов yellow, мутации по которым блокируют темновое восстановлениеПХЛД, необходимо для регуляции активности тПОР [Cahoon and Timko, 2000].74Биологическая природа и механизмы действия этих регулятров крайне интересны,но пока неизвестны.ТемновойбиосинтезХЛобеспечиваетсянетолькогенами,контролирующими накопление и регуляцию тПОР.

Помимо мутантов yellow, ухламидомонады описан иной тип бесхлорофилльных зеленеющих на светумутантов по темновому биосинтезу ХЛ, которые накапливают в темнотепротопорфирин IX  более ранний, чем ПХЛД, предшественник ХЛ [Wang et al.,1974; Чекунова и Квитко, 1986; Шалыго и др., 1990]. Комплексное генетикобиохимическое исследование этих мутантов Brc-1 и Lts3 позволило найтиспецифичныйдляэукариоттранскрипционныйфакторLTS3семействаZnF_GATA, необходимый для экспрессии в темноте генов, кодирующих магнийхелатазу – фермент, функционирующий на более раннем, чем ПОР этапебиосинтеза ХЛ [Чекунова, и Савельева, 2010].

Обнаружение этого факторасвидетельствует, что независимый от света биосинтез тетрапирролов вфотосинтезирующей клетке обеспечивается и путем транскрипционной регуляциигенов, кодирующих магний-хелатазу.Наши представления о генетике более архаичного темнового синтезахлорофилла еще только формируются. Исследования в этой области позволятвыяснить роль геномов ядра и хлоропластов в регуляции этого процесса, а также вобеспечении адаптации фототрофов к важнейшему для них фактору внешнейсреды – свету.1.5. Катаболизм хлорофилловДеградацию хлорофиллов можно наблюдать как потерю зеленой окраски(пожелтение) в разные периоды жизни растений: во время старения, созреванияплодов и/или при гибели листьев в результате внешних повреждений, включаяэкстремальные температуры и воздействия патогенов.

Быстрое разрушениесвободных хлорофиллов – адаптивное свойство, которое предотвращает75фотодинамические повреждения, способствуя выживанию клетки в условияхосвещения. Ежегодно на земле деградации подвергается около 1,2 млрд. тоннхлорофиллов [Hendry et al., 1987]. Механизмы этого процесса до середины 80-хгодов 20 столетия оставались малоизвестными [Matile et al., 1996].

Решающуюроль в их изучении сыграли мутанты с нарушенным катаболизмом пигмента. Ихисследования привели к обнаружению ферментов деградации хлорофиллов(рисунок 1.18) и кодирующих их генов [Hörtensteiner, 1999; 2006].Хлорофиллы разрушается до водорастворимых бесцветных форм, которыенакапливаются в вакуолях. Продукты их распада были установлены методамихроматографииприсравнительныхисследованияхпигментногосоставажелтеющих в темноте (в процессе старения) нормальных растений и мутантов,сохраняющих в этих условиях зеленую окраску. Среди множества продуктовдеградации14С–меченных хлорофиллов были обнаружены три формы, которыенакапливалисьвлистьяхмутантов:фитолы,красныеводорастворимыететрапирролы и бесцветные катаболиты хлорофилла, представленные двумягруппами - флуоресцирующие и нефлуоресцирующие [Matile et al., 1996].Рисунок 1.18.

Пути деградации молекул хлорофиллов (ХЛ). В рамочках указаныферменты: хлорофиллаза (CHL), магний-дехелатаза (- Mg2+), феофитиназа (PPH),феофорбид a-оксигеназа (PAO), редуктаза красных катаболитов ХЛ (RCCR),хлорофилл б-дегидрогеназа/редуктаза (NYC1), и хлорофилл б-редуктаза (NOL)761.5.1. Образование окрашенных катаболитов хлорофилловДеградация хлорофиллов (ХЛ) начинается с потери «фитольного хвоста» ицентрального атома магния, в результате чего образуются светло-зеленыепигменты феофорбиды.

Мутанты c нарушениями этих реакций не имеютсобственного фенотипа, и стратегия поиска мутантных генов, как правило,строится на анализе первичной структуры молекулы кодируемого ими фермента.На ее основе создают праймеры для амплификации фрагментов гена интереса,которые далее используют в качестве зондов для поиска кДНК и геномной ДНКэтих генов в соответствующих библиотеках.Хлорофиллаза ˗˗ один из первых ферментов, выделенных из растений[Willstatter and Stoll, 1913], - осуществляет гидролиз ХЛ с образованиемхлорофиллида «а» и фитола (рисунок 1.18). К концу 20 века этот белок былизучен методами биохимии.

Информация о его первичной структуре далавозможность осуществить поиск кодирующего его гена, ˗˗ в 1999 году былиопубликованы результаты клонирования генов хлорофиллазы арабидопсиса(AtCLH1) и лимона (CHLASE1) [Tsuchiya et al., 1999; Jakob-Wilk et al., 1999].Вскоре была найдена еще одна хлорофиллаза арабидопсиса - CLH2, и показано,что мутанты, лишенные обоих ферментов, способны к деградации хлорофилла[Schen et al., 2007]. Эти данные заставили вновь начать поиск ферментахлоропласта, необходимого для катаболизма ХЛ во время старения листьев.Такой белок – феофитиназа (Pheophytinase, PPH), был найден благодаря методамбиоинформатики и обратной генетики [Schelbert et al., 2009].

Зная функциифермента, авторы нашли в протеоме арабидопсиса 462 α/β-гидролаз, из которых30 имели хлоропластную локализацию. Экспрессия генов трех из этих белковактивировалась в период старения, а среди инсерционных (Т-ДНК) мутантов поэтим трем генам только один имел мутантный (staygreen) фенотип.