Диссертация (Генетический контроль ранних этапов биосинтеза хлорофилла у зелёной водоросли Chlamydomonas reinhardtii), страница 12

При этом они имеют значительноесходство с субъединицами нитрогеназы эубактерий NifHDK [Fujita and Bauer,2000].Нитрогеназа – это чувствительный к кислороду ферментный комплекс,встречающийся только у прокариот, который восстанавливает молекулярный азотс использованием АТФ и донора электронов:N2 + 8H + 8e+ 16АТФ  2NH3 + H2 + 16АДФ + 16Ф.Голофермент состоит из двух компонентов: Fe-белка и MoFe-белка (рисунок1.14). Fe-белок – это электрон-донорный гомодимер массой около 64 kDa,кодируемый геном nifH.

Он имеет два Mg-ATФ-связывающих сайта и содержитчувствительныйккислороду [Fe4S4]-кластер,лигандированныйчетырьмяостатками цистеина, - по два от каждого мономера. MoFe-белок - гетеротетрамермассой около 230 kDa, состоящий из субъединиц NifD и NifK. Каждая парасубъединиц содержит P-кластер [Fe8S8] и Fe-Mo кофактор [Fe7MoS9]. Доноромэлектронов служит восстановленный ферредоксин - маленький растворимыйРисунок 1.14. Структурное сходство нитрогеназы и тПОР (DPOR) (Схематическиемодели ферментов даны по: Bröcker et al., 2008)62белок (11 кДа), содержащий кластер [2Fe-2S] как простетическую группу.

Вследза гидролизом молекул Mg-АТФ, Fe-белок переносит электроны от ферредоксиначерез P-кластеры к Mo–содержащим редокс-центрам тетрамера NifD2K2, а тот, всвоюочередь,триждыотдаетпаруэлектроновмолекулесубстрата,восстанававливая ее до двух молекул аммиака [Rubio and Ludden, 2005]. Приобилии полученных в течение последних 50 лет генетических и молекулярногенетических данных о темновом восстановлении ПХЛД, исследования биохимииэтого процесса начались сравнительно недавно.Из клеток R. capsulatus удалось изолировать тПОР, и ее активность былаизученаinvitro. ЭкстрактысубъедиництПОР получалив результатесверхэкспрессии генов bchL и bchNB, введенных в геном R.

capsulatus спомощью сконструированных плазмид (Nomata et al., 2005). Авторы установили,что фермент состоит из двух компонентов: L-белка и NB-белка, и для егоактивности необходимы АТФ и донор электронов. Данные хроматографиисвидетельствовали, что первый из них существуеткак гомодимер (bchL)2, авторой - как гетеротетрамер (bchN)2(bchB)2 с молекулярной массой 67 kDa и 200kDa, соответственно. Молекулярная масса белков: L, N, и B, расчитанная поаминокислотнойпоследовательностипродуктовкодирующихихгенов,составляет 36, 48 и 57 kDa, соответственно. Основываясь на сходстве тПОР снитрогеназами (рисунок 1.14), авторы предположили, что L-белок функционируеткак АТФ-зависимый донор электронов для NB-белка, который содержиткаталитический сайт для редукции ПХЛДа. Действительно, в соответствии снедавно установленной кристаллической структурой тПОР R.cupsulatus, каждаякаталитическая единица BchN-BchB содержит один ПХЛД и один [Fe4S4] кластер,лигандированный остатком аспартата и тремя цистеинами остатками (Muraki et.al., 2010).

В присутствии АТФ L-белок (BchL)2 передает 2 электрона отферредоксина на NB-белок (BchN-BchB)2, который содержит каталитический сайтдля восстановления ПХЛД. Пространственная структура NB кластера и ПХЛДоказались соответственно идентичными P-кластеру и кофактору Fe-Mo в MoFe-63белке нитрогеназы (рисунок 1.14). Сходство пространственных структур обоихферментов свидетельствует, что субъединицы ChlL, ChlB и ChlN оказалисьфункционально сходными с субъединицами нитрогеназы бактерий NifH, NifK иNifD.Подобно нитрогеназам, тПОР цианобактерий чувствительна к кислороду. Вопытах in vitro O2 ингибировал активность белков ChlL и ChlN-ChlB в течение 5 и30 минут, соответственно [Yamamoto et al., 2009]. По-видимому, оксигенныефототрофы научились защищать тПОР от воздействияO2, и природусоответствующих регуляторных механизмов еще предстоит выяснить.В клетках пурпурной бактерии R. сapsulatus найден еще один фермент,похожий на нитрогеназу – это хлорофиллид-оксидоредуктаза (ХОР), кодируемаягенами bchXYZ (рисунок 1.11), которая превращает ХЛДа в БХЛa [Nomata, 2006].Аминокислотная последовательность полипептида BchX сходна с таковойсубъединицы NifH нитрогеназы и имеет 32% идентичности с продуктом генаbchL.

Более того, BchY и BchZ – две другие субъединицы ХОР  гомологичныбелкам BchN/ChlN и BchB/ChlB, соответственно. Структурное и функциональноесходство ферментных комплексов тПОР (BchL,N,B) и ХОР (BchX,Y,Z) у R.capsulatus дает основания говорить об общности их происхождения. Вероятно,они появились в результате дупликации и дивергенции предковых генов,кодировавших менее специфичные поотношению к субстрату ферменты,способные восстанавливать ПХЛД [Raymond et al., 2004].1.4.3. Светозависимый биосинтез хлорофиллидаПроростки высших растений, выращенные в темноте, окрашены в желтыйцвет и морфологически отличаются от зеленых, растущих на свету. Иххлоропласты не содержат тилакоидов и хлорофилла, биосинтез которогоостановлен на стадии образования ПХЛД, и представляют собой этиопласты спроламеллярным телом и отходящими от него протилакоидами, на которыхаккумулируются стабильные комплексы сПОР (рисунок 1.15А).64.Рисунок 1.15.

Электронные микрофотографии пластид из листьев гороха.Пластиды имеют двухслойную оболочку (E), окружающую строму (S) (по: Aronssonet al., 2003). 1.15А. Этиопласт из проростков, выращенных в темноте. Внутренниемембраны этиопластов состоят из проламеллярного тела (PLB) с отросткамипротилакоидов (PT). 1.15B. Хлоропласт зеленого листа. Внутренняя мембранапредставляет собой хорошо разветвленную систему тилакоидов, состоящих из ламеллгран (LG) и ламелл стромы (LS). Линейка – 1 mВ клетках таких этиолированных проростков свет запускает процессзеленения: ПХЛД превращается в ХЛД и далее в ХЛ; затем ПОР перемещается впротилакоиды [Ryberg and Dehesh, 1986], и происходит дифференциацияэтиопластов в хлоропласты, когда проламеллярные тела и протилакоидытрансформируются в тилакоиды с развитой ламеллярной системой (рис. 1.15Б).Стартовым механизмом этих структурно-функциональных изменений служитрецепция света сПОР.

К настоящему времени он подробно описан [Lebedev andTimko, 1998; Беляева, 2009], и здесь мы остановимся лишь на кратком изложенииистории открытия сПОР и генетических аспектах его исследований.Генетический контроль фотопревращения ПХЛД. Впервые о выделениииз этиопластов пигмент-белкового комплекса, в отсутствии которого непроисходит восстановление ПХЛД, сообщили А.А. Красновский [Красновский,1952], и Смит с Бенитезом [Smith and Benitez, 1953], которые назвали его«протохлорофиллид-голохромом».Установлениекорреляциимеждууменьшением содержания ПХЛД и увеличением содержания ХЛД при освещении65этиолированных листьев в условиях низких температур [Smith and Trench, 1958]давали основания предполагать, что голохромный белок является фотозависимойредуктазой.

Эта гипотеза получила подтверждение в конце 70-х годов, когдаcПОР молекулярной массой 36 kDa была выделена из проростков ячменя [Apel etal., 1980], а затем других растений. Ген Por ячменя, который кодирует сПОР, былклонирован первым среди генов, контролирующих биосинтез ХЛ у растений[Schulz et al., 1989]. Авторам удалось выделить сПОР в количестве, достаточномдля создания антител, которые были использованы для поисков гена этогофермента в библиотеке кДНК. В дальнейшем этот ген был идентифицирован уразных растений: пшеницы, овса, гороха, арабидопсиса и сосны, а также ухламидомонады и цианобактерии Synechocystis sp.

[Reinbothe, Reinbothe, 1996].Мутанты C. reinhardtii по генам, кодирующим сПОР, были получены врезультате мутагенеза клеток термочувствительного желтого мутанта y-1-4(фенотип: желтый в темноте, зеленый на свету), как штаммы, неспособныезеленеть на свету при непермиссивной температуре. Генетический анализпоказал, что такой фенотип обусловлен мутациями в ядерном локусе pc-1,картированном в I группе сцепления на 1 сМ дистальнее локуса y-5 [Ford et al.,1981; 1983].

Оказалось, что pc-1 это мутация, приводящая к сдвигу рамкисчитывания в гене Por1, кодирующем сПОР. Клетки мутантов генотипа pc-1 былиспособны синтезировать 52 и 36% хлорофилла дикого типа в темноте и на свету,соответственно. Это означало, что в отсутствии сПОР механизм темновоговосстановления ПХЛД может функционировать и на свету [Li, Timko, 1996].Несколько генов, кодирующих изоформы белка ПОР (PORA, PORB, PORC)имеются у A.

thaliana [Oosawa et al., 2000], ячменя [Holtorf et al., 1995], инекоторых видов голосеменных растений [Skinner, 1999], тогда как в геномецианобактерий и хламидомонады [Li and Timko, 1996] он мономорфен. У всехизученных растений гены POR по-разному регулируются светом.