Диссертация (Генетический контроль ранних этапов биосинтеза хлорофилла у зелёной водоросли Chlamydomonas reinhardtii), страница 13
Описание файла
Файл "Диссертация" внутри архива находится в папке "Генетический контроль ранних этапов биосинтеза хлорофилла у зелёной водоросли Chlamydomonas reinhardtii". PDF-файл из архива "Генетический контроль ранних этапов биосинтеза хлорофилла у зелёной водоросли Chlamydomonas reinhardtii", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "биология" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве СПбГУ. Не смотря на прямую связь этого архива с СПбГУ, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой докторскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени доктора биологических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст 13 страницы из PDF
Он ингибируетэкспрессию PORA - ген активно транскрибируется только в этиолированных66проростках, и активируетэкспрессию генов PORB и PORC при переносерастений из темноты на свет [Frick et al., 2003]. Роль различных изоформ cПОР икодирующих их генов в превращении ПХЛД в ХЛД, в биогенезе тилакоидов, вформировании комплекса сПОР, защите от фотоокисления и в процессе зелененияв настоящее время усиленно изучается [Литвин и Беляева, 2007; Беляева, 2009:Masuda and Takamiya, 2005].МолекулярнаяструктурабелкасПОР.Продуктпервогоизклонированных генов Por1 ячменя это белок из 388 аминокислотных остатков схлоропластным транзитным пептидом размером 74 ак [Schulz et al., 1989]. Вдальнейшем, гены, кодирующие сПОР, были изолированы из организмов,относящихся к разным таксономическим группам, от цианобактерий до высшихрастений [Schoefs and Franck, 2003].
Первичная структура кодируемых имибелков характеризуется высоким содержанием аминокислот с основнымисвойствами и большим количеством гидрофобных аминокислотных остатков.Молекулывсех, известныхк настоящему времени, сПОР содержат 4консервативных остатка цистеина (у гороха - в позициях 119, 170, 280 и 307),один из которых может быть вовлечен в связывание с ПХЛД (рисунок 1.16).Вторичная структура сПОР установлена на основе спектров кругового дихроизмамономерного белка - его молекула состоит из 89 -спиралей (33%), 7 -цепей(19%), 20% поворотов и 28% случайных петель [Birve et al., 1996].
Показано, чтомолекула сПОР присоединяется к мембране двухсторонними сегментами,содержащими остатки триптофана, локализованного около С-конца, илигидрфобными петлями. Сравнение структуры сПОР со структурой других НАДФзависимыхбелковпозволилоотнестиэтотферментксемействуалкогольдегидрогеназ [Beale, 1999]. Ферменты этого семейства катализируютНАДФ(Н)-зависимые реакции, включающие перенос гидрид-иона и протона.Определение кристаллической структуры некоторых из представителей семействапозволило создать гомологическую модель функционирования сПОР.67Рисунок 1.16.
Трехмерная модель структуры комплекса сПОР-ПХЛД-НАДФНSynechocystis (по:Sytina et al., 2008). 1.16a. В молекуле сПОР центральный β-слой,состоящий из 7-ми β-тяжей, окружен девятью α-спиралями. Уникальная для сПОРвнешняя петля из 33 аминокислотных остатков (красный цвет), по-видимому,вовлечена в связывание с протохлорофиллидом (зеленый цвет). 1.16b. Моделькаталитической реакции. Реакция фотохимической гидрогенизацииполуизолированной двойной связи С17–С18 в кольце D молекулы ПХЛД происходитза счет протона от Tyr189 и водорода от НАДФНЛокализация и функционирование сПОР.
Очищеный белок, кодируемыйгеном POR1, in vitro – мономер массой 3538 kDa [Oliver and Griffith, 1980; Apel etal., 1980]. В условиях in vivo сПОР связан с мембранами пластид. Образованиекомплекса этого фермента с НАДФН и ПХЛД является необходимым условиемстабильной ассоциации с тилакоидами. Полагают, что в этом комплексе ПХЛДслужит фоторецептором [Griffiths, 1991], а НАДФН выступает в качестве донораэлектронов, которые передаются ПХЛД [Griffiths et al., 1996].
Если комплекс необразуется, то сПОР разрушается протеазами в строме пластид [Beale, 1999].Транскрипты ядерных генов, кодирующих сПОР, обычно накапливаются вцитозоле около поверхности пластид [Marrison et al., 1996], где и происходит ихтрансляция на 80S рибосомах [Batschauer et al., 1982]. Молекулы пре-сПОР,содержащиехлоропластныетранзитныепептиды,транспортируютсявхлоропласты. В это время они взаимодействуют с белками PTC (сокр.
англ.:protochlorophyllide-dependenttranslocationcomplex),которыеявляютсякомпонентами Toc/Tic-транслоконов - комплексов, которые расположены по обе68стороны оболочки хлоропласта и обеспечивают импорт белков из цитоплазмы[Reinbothe et al., 2004; 2005]. Существование ПХЛД-зависимых транслоконов[Schemenewitz et al., 2007] подтвердило обсуждаемую с 1995 г. гипотезу обучастии ПХЛД в регуляции транспорта белков в хлоропласт [Reinbothe et al.,1995]. Установлено, что для ассоциации cПОР с тилакоидами в качествекофактора необходим НАДФ [Dahlin et al., 1999]. Возможная роль в этомпроцессе вторичной структуры сПОР активно обсуждается [Беляева, Литвин,2007; Aronsson et al., 2003].Если этиолированные проростки покрытосеменных растений осветить втечение нескольких часов, а затем снова поместить их в темноту, они продолжаютсинтезировать ХЛ на уровне 2030% нормы [Popov and Dilova, 1969; Adamson etal., 1985].
Отвечая на вопрос, каким образом осуществляется этот синтез вотсутствие тПОР, Раскин и Шварц [Raskin and Schwartz, 2003] установили, чтоингибированиеаскорбат-пероксидазысалициловойкислотойведеткпрекращению темнового синтеза ХЛ у ячменя. Они предположили, что в темнотепревращение ПХЛД в ХЛД может осуществлять и сПОР, которая используетэлектроны,полученныеотаскорбата.Методомнизкотемпературнойспектроскопии показали, что каталитический механизм сПОР включает двепромежуточные стадии, не требующие света, которые могут быть связаны сизменением положения или конформации молекулы фермента [Heyes et al., 2003].Происхождение и эволюция ПОР.
Первоначально полагали, что сПОРпоявилась в процессе эволюции только у прокрытосеменных растений, однако, в90-х годах XX века выяснилось, что геномы цианобактерий и водорослей такжесодержат гены этого фермента (рисунок 1.17). У цианобактерии Syneсhocystis sp.PCC6803 он был обнаружен как ген, который, будучи трансформирован,комплементирует мутацию, подобную той, что блокирует тПОР у R. сupsulatus[SuzukiandкодируемогоBauer,1995].этимгеном,Аминокислотнаяоказаласьпоследовательностьсходнойсбелка,аминокислотной69последовательностью сПОР высших растений.
Филогения субъединиц сПОР иблизких к ней ферментов семейства короткоцепочечных дегидрогеназ/редуктазсвидетельствовала,чтоэволюционнаяисториягеновсПОРначаласьсцианобактерий (рисунок 1.17), а эукариоты получили их в результатеэндосимбиотического горизонтального переноса, случившегося до моментадивергенции фототрофных ядерных организмов [Yangand and Chen, 2004; Fongandand Archibald, 2008]. Молекулярная филогения тПОР однозначно свидетельствуетРисунок 1.17. Молекулярная филогения тПОР и сПОР (по: Yamazaki et al., 2006)70о происхождении кодирующих его генов от нитрогеназ бактерий [Xiong et al.,2000; Yamazaki et al., 2006].1.4.4.
Эффективность биосинтеза хлорофиллов в темноте и на светуПервичная оценка эффективности темнового и светового биосинтеза ХЛможет быть дана путем измерения уровня этих пигментов в клетках дикого типа ибесхлорофильных мутантов, выращенных в темноте и на свету. При изучениивлияния освещения на накопление ХЛ у нескольких видов сосны былоустановлено, что в темноте 1422-х дневные проростки Pinus (P.) taeda [Griffiths,1991], P.
thunbergii [Shinohara et al., 1992] и P. sylvestris [Drumm-Herrel and Mohr,1994] синтезируют 2025% светового уровня ХЛ. У мутантов цианобактерий снеактивным комплексом тПОР на свету полностью восстанавливается уровеньсодержания ХЛ за счет активности сПОР. У мутантов P. boryanum с дефектнымигенами chlL, chlM и chlN скорости накопления ХЛ при фототрофном росте так же,как и в хемогетеротрофных условиях в темноте, были сходны с таковыми уштаммов дикого типа [Fujita et al., 1998]. Аналогичные результаты былиполучены на мутантах Synechocystis sp. по генам chlL и chlN [Wu and Vermas,1995]; свидетельствуя, что светонезависимый биосинтез ХЛ не являетсянеобходимым для световых культур цианобактерий.Многие yellow-мутанты хламидомонады (как ядерные, так и хлоропластные)при росте на свету накапливают меньше ХЛ, чем штаммы дикого типа.
Взависимости от генотипа его содержания снижается до 35% (мутант y-5) и7898% (мутант y-1a) от уровня дикого типа [Ford and Wang, 1980; Ford et al.,1981]. Клетки мутанта pc-1 C. reinhardtii, у которого не функционирует сПОР, втемноте содержат наполовину меньше ХЛ, чем штаммы дикого типа,выращенные в сходных условиях [Ford et al., 1981; 1983; Li and Timko, 1996].Возможно, что отсутствие светозависимого фермента каким-то образом снижаетуровень темнового синтеза ХЛ, оказывая влияние либо на активность тПОР, либона содержание ПХЛД. На свету этот мутант накапливает 36% ХЛ дикого типа.71По-видимому, такой уровень пигмента обеспечивается активностью тПОР.Способность мутанта pc-1 накапливать на свету втрое больше ХЛ, чем в темноте,позволяет предпожить, что светонезависимая редукция ПХЛД может позитивнорегулироваться светом.1.4.5.
Проблемы и перспективы изучения темновго синтеза хлорофиллаЕще в начале 90-х годов XX века считали, что темновой биосинтез ХЛ результат биохимических модификаций cПОР. Сейчас очевидно, что темновое исветозависимоевосстановлениеПХЛДконтролируютсяразнымигенами,кодирующими два разных по стуктуре и происхождению ферментных комплекса.Методами классической и молекулярной генетики и геномики при изучениифотосинтезирующих бактерий, зеленых водорослей и высших растений былинайдены три гена, контролирующие светонезависимое превращение ПХЛД в ХЛД сhlL, сhlB и сhlN (bhlL, bhlB и bchN у бактерий, синтезирующих БХЛ). Эти геныкодируют субъединицы ферментного комплекса тПОР, сходные по структуре ссубъединицами нитрогеназы NifHDK [Muraki et al., 2010]. Они обнаруженытолько у организмов, синтезирующих ХЛ в темноте, и у представителей эукариотлокализованы в геномах пластид [Armstrong, 1998; Nomata et al., 2005].Подобно ДНК-фотолазе [Begly, 1994], сПОР – это фотоэнзим, или фермент,которому для проявления каталитической активности необходим свет.