Диссертация (Сигнальная регуляция развития симбиоза гороха Pisum sativum L. с клубеньковыми бактериями)

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕУЧРЕЖДЕНИЕ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИНа правах рукописиДолгихЕлена АнатольевнаСИГНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ РАЗВИТИЯСИМБИОЗА ГОРОХА PISUM SATIVUM L. С КЛУБЕНЬКОВЫМИБАКТЕРИЯМИШифр и наименование специальности:03.01.05 Физиология и биохимия растений03.02.03 МикробиологияДиссертацияна соискание ученой степенидоктора биологических наукНаучный консультант:доктор биологических наук, профессор Тихонович Игорь АнатольевичСанкт-Петербург2016СодержаниеВведение9Глава I.

Современные представления об особенностях сигнального обменамежду бобовыми растениями и микроорганизмами при формированииcимбиотических отношений (обзор литературы)1.1. Избирательностьвзаимодействиярастений15смикроорганизмамиопределяется способностью растений распознавать на молекулярном уровнеотличительные особенности микроорганизмов151.2. Сигнальный обмен между бобовыми растениями и микроорганизмами наранних этапах формирования симбиотических отношений181.2.1. Развитие азотфиксирующих клубеньков у бобовых растений являетсярезультатом тонкой координациипроцессов в эпидерме и коре корнябобовых растений231.2.2. Гены, контролирующие развитие бобово-ризобиального симбиоза261.2.3.

Представители семейства LysM-рецепторных киназ необходимы дляконтроля взаимодействия растений с симбиотическими микроорганизмами271.2.4. Комплексы LysM-рецепторных киназ могут быть вовлечены в контрольответных реакций бобовых растений на действие Nod-факторов351.2.5. Роль внеклеточных доменов LysM-РПК в различении структурныхособенностей Nod-факторов411.2.6. Математическое моделирование взаимодействия LysM-РПК c Nodфакторами421.2.7. Минимальные изменения в киназном домене LysM-рецептор-подобныхкиназ связаны с дивергенцией сигнальных путей, ведущих к развитиюсимбиоза и патогенеза461.3. Характеристика компонентов «общего сигнального пути» у бобовыхрастений, активируемого Nod-факторами481.3.1.

Компоненты сигнального каскада, необходимые для развития2инфекции и органогенеза клубеньков531.3.2. Регуляция выхода бактерий из инфекционных нитей и развитиясимбиосом у бобовых растений611.3.3. Гены, вовлеченные в контроль органогенеза клубеньков бобовыхрастений651.4. Участие фитогормонов ауксинов и цитокининов в контроле органогенезаклубеньков бобовых растений681.4.1.

Особенности регуляции транспорта ауксинов у растений691.4.2. Ключевые регуляторы биосинтеза цитокининов у растений741.5. В регуляцию органогенеза клубеньков у бобовых растений может бытьвовлечен комплекс регуляторов пролиферации и дифференцировки клеток 761.5.5. Участие транскрипционных факторов KNOX и WOX семейств впроцессах морфогенеза у растений81Заключение83Глава 2. Методические подходы872.1.Штаммы микроорганизмов872.2. Растительный материал872.3. Условия выращивания растений872.4. Получение растительных экстрактов882.5.

Вестерн-блот-анализ882.6. Трансформация бактерий882.7. Выделение плазмидной ДНК892.8. Выделение растительной ДНК892.9. Количественный анализ экспрессии генов с помощью ОТ-ПЦР сдетекцией в реальном времени902.10. Анализ взаимодействия белков при кратковременной экспрессии влистьях Nicothiana benthamiana912.11. Клонирование фрагментов ДНК для синтеза внеклеточных доменов иполноразмерных рецепторов гороха9132.12. Анализ связывающей способности рецепторов с Nod-факторами922.13. Конструирование векторов для эктопической экспрессии генов и РНКинтерференции922.14. Трансформация растений с помощью Agrobacterium rhizogenes932.15. Анализ активности репортерного белка бета-глюкуронидазы втрансгенных тканях растений942.16. Выделение и анализ цитокининов952.17.

Статистические методы и компьютерные программы95Глава 3. Результаты и обсуждение.Часть 1. Изучение сигнального обмена между горохом P. sativum L. иклубеньковыми бактериями на начальных этапах развития симбиоза961.1. Поиск молекулярных маркеров, экспрессия которых могла быть связанас активацией разных сигнальных путей у гороха при рецепции Nod-факторов991.1.1.

Анализ экспрессии генов ранних нодулинов PsEnod5 и PsEnod12a усимбиотических мутантов гороха1001.1.2. Анализ участия рецептор-подобных киназ Sym10 и Sym37 в активациисигнальных путей у гороха1061.2. Изучение биохимической функции рецептор-подобных киназ горохаSym10 и Sym37, необходимых для развития симбиоза1101.2.1. Синтез внеклеточных доменов рецептор-подобных киназ Sym10 иSym37 гороха в бактериальной системе и анализ связывающей способности слигандом1101.2.1.1. Конструирование векторов, обеспечивающих внутриклеточныйсинтез белков-рецепторов Sym10 и Sym37 в бактериях E. coli1111.2.1.2. Оптимизация условий наработки рекомбинантных белков-рецепторовв штамме E.

coli С411131.2.1.3. Очистка рекомбинантных белков Sym10-ECD и Sym37-ECD методомметаллохелатной аффинной хроматографии41141.2.1.4. Анализ связывающей способности внеклеточных доменов Sym10ECD и Sym37-ECD, полученных при гетерологичной экспрессии в бактериях,с Nod-факторами1171.2.2. Синтез полноразмерных белков-рецепторов Sym10 и Sym37 в листьяхN. benthamiana и анализ их связывающей способности с Nod-факторами 1191.2.2.1. Изучение связывающей способности синтезированных в растенияхполноразмерных рецепторов с Nod-факторами1221.3. Выявление новых кандидатов на роль рецепторов к Nod-факторам угороха и оценка их способности контролировать развитие симбиоза1251.3.1. Компьютерное моделирование связывания LysM-РПК К1 c Nodфакторами Rh.

leguminosarum bv. viciae NodRlv-IV, V, C18:4, Ac1251.3.2. Синтез внеклеточного домена рецептор-подобной киназы К1 вбактериях E. coli и анализ связывания с NodRlv-IV, V, C18:4, Ac1291.4. Фенотипический анализ мутантов по гену k1 у гороха1291.5.1 Анализ способности рецептор-подобных киназ гороха P. sativum L.формировать олигомерные комплексы при ко-экспрессии в листьях N.benthamiana1311.5.2. Изучение взаимодействия между рецепторами Sуm10, К1 и Sym37 прико-экспрессии в листьях N.

benthamiana131Заключение по части 1137Часть 2. Поиск у гороха потенциальных рецепторов к хитоолигосахаридам сразной степенью полимеризации, необходимых для развития симбиоза иактивации защитных систем растения1392.1. Поиск и изучение потенциальных рецепторов к хитоолигосахаридам сразной степенью полимеризации у гороха P.

sativum L.1402.2. Анализ участия рецепторной-киназы Lyk9 в контроле развития симбиозас грибами арбускулярной микоризы1432.1. Анализ влияния рецепторной-киназы Lyk9 на развитие устойчивостигороха к фитопатогенным грибам14752.4. Получение хитоолигосахаридов с разной степенью полимеризации спомощью биологического синтеза2.4.1.Конструирование149векторов,обеспечивающиххитоолигосахаридов (n = 5 и 6) в бактериях E. coliсинтез1502.4.2. Анализ биологической активности хитоолигосахаридов, полученныхбиосинтетическим способом152Заключение по части 2154Часть 3.

Анализ взаимодействия компонентов сигнального каскада,активируемого Nod-факторами с фитогормонами и основными регуляторамипролиферации и дифференцировки клеток при симбиозе1553.1. Локализация ответа на цитокинины и ауксины у растений гороха спомощью цитокинин- и ауксин-регулируемых репортерных конструкцийpRR4::GUS и DR5::GFP1593.2. Поиск у гороха генов первичного ответа на цитокинины (RR А- и Bтипа), а также генов, контролирующих биосинтез цитокининов и их переходв активное состояние (IPT и LOG), экспрессия которых возрастает приразвитии симбиоза1663.2.1. Выявление и анализ экспрессии генов гороха, активация которыхпроисходитприрецепциирастениямифитогормонов(регуляторов «первичного ответа» гороха на цитокинин)цитокининов1663.2.2.

Выявление генов IPT и LOG, контролирующих биосинтез цитокининови их переход в активное состояние у гороха1673.2.3. Анализ содержания различных форм цитокининов в корнях гороха приинокуляции Rh. leguminosarum bv. viciae CIAM10261733.3. Идентификация генов гороха, контролирующих биосинтез (TAR) итранспорт ауксинов (PIN)1753.4. Анализ взаимодействия между компонентами сигнального каскада,активируемого Nod-факторами, и регуляторами фитогормонального ответа17863.4.1. Изучение влияния экзогенного цитокинина БАП на регуляторыцитокининового ответа и основные транскрипционные факторы сигнальногокаскада, активируемого Nod-факторами, у гороха1783.4.2. Сравнительный анализ экспрессии генов, контролирующих биосинтез/активацию цитокининов и цитокининовый ответ у мутантов гороха1803.4.3.

Локализация ответа на цитокинины и ауксины у мутантов SGEFix - -2,SGEFix- -5(sym33) с помощью репортерных конструкций pRR4::GUS иDR5::GFP184Заключение по части 3187Часть 4. Изучение роли гомеодомен-содержащих транскрипционныхфакторов KNOX и WOX семейств в формировании клубеньков у гороха. 1904.1 Изучение роли генов KNOX при развитии клубеньков у гороха P. sativumL.1934.1.1 Идентификация генов семейства KNOX, играющих существенную рольв контроле формирования клубеньков у гороха1934.1.2. Анализ влияния транскрипционного фактора KNOX3 на уровеньэкспрессии генов, контролирующих метаболизм цитокининов у гороха1964.2.