Диссертация (Роль надпочечников в регуляции метаболизма меди в печени), страница 5

1.2 Б), где его трансмембранные домены образуют канал, покоторому ионы Cu(I) проходят сквозь билипидный слой (De Feo et al., 2009).Рис. 1.2. Структурная модель CTR1 (Kim et al., 2008).А – мономер CTR1 человека содержит два богатых метионином внеклеточных домена, тритрансмембранных домена, а также внутриклеточный домен, содержащий остатки цистеина игистидина. Б – гомотример CTR1 в липидном бислое. Между субъединицами тримераформируется пространство с низкой электронной плотностью, по которому способныпроходить ионы Cu(I).Мультимеризация CTR1 стимулируется действием гормонов, таких какэстрогены, прогестерон, инсулин (Hardman et al., 2006).

N-концевой доменсодержит два богатых метионином и гистидином участка, включающие мотивMX2M. Эти участки связывают медь и облегчают ее переход через канал (Puig etal., 2002). Второй трансмембранный домен содержит аналогичный медьсвязывающий мотив MX3M, необходимый для захвата ионов меди путем25формирования Cu-Sсвязей.Цитозольный домен также содержитмедь-связывающие мотивы, структуры которых отличаются у животных различныхтаксонов. Так, у дрожжей это богатые цистеином кластеры, а у позвоночных –консервативный мотив His-Cys-His (Puig and Thiele, 2002). Связывание медибелком CTR1 является процессом, зависимым от времени, температуры изначения pH (Lee et al., 2002).Белок CTR1 осуществляет транспорт ионов меди в состоянии окисленияCu(I), но большая часть пищевой меди находится в состоянии Cu(II), т.е. дляпопадания внутрь клетки ион меди должен быть восстановлен.

Внеклеточныйлиганд, доставляющий медь к CTR1, а также механизм восстановления иона медидо сих пор неизвестны. Возможно, в этом процессе принимают участиенеспецифические мембранные редуктазы семейства STEAP (Ohgami et al., 2006).Так, исследование редуктазы Steap3, проведенное на миелоидных клеткахкостного мозга, поддерживает предположение об участии этой редуктазы ввосстановлении Cu(II) на плазматической мембране (Knutson, 2007).Белок CTR1 играет важную роль в процессе эмбрионального развития,выступая как транспортер меди и как регулятор сигнальных путей клетки.Мышиные эмбрионы с генотипом Ctr1-/- погибали, не способные к гаструляции, вто время как у мышей Сtr1+/- экспрессия CTR1 была снижена в два раза посравнению с мышами Сtr1+/+ (Lee et al., 2001; Kuo et al., 2006).

Нарушениесигнальных путей является важным признаком формирования и развитияопухолей. Поскольку CTR1 принимает участие в регуляции сигнальных путей, онможет быть мишенью для потенциальных средств химиотерапии. Кроме того,CTR1 является основным транспортером в клетку терапевтических препаратов наоснове платины (Ishida et al., 2002; Zatulovskiy et al., 2012).Белок CTR2 у млекопитающих располагается преимущественно вовнутриклеточных мембранах клеток, таких как мембраны вакуолей, везикул,эндосом и лизосом, но его локализация может изменяться в зависимости от типаклеток и уровня содержания меди (van den Berghe et al., 2007).

Небольшоеколичество белка может также располагаться на плазматической мембране клетки.26Гистологические исследования показали высокое содержание CTR2 в сердце иплаценте. Основной функцией CTR2 в клетках взрослых животных являетсярециклизация меди из внутриклеточных запасов (Bertinato et al., 2008). Былопоказано, что CTR2 структурно гомологичен второму трансмембранному доменубелка CTR1, наиболее важному в процессе транспорта меди (Zhou and Gitschier,1997).Экскрецию меди из клеток выполняют белкиATP7Aи ATP7B,принадлежащие к семейству АТФаз типа P1B. Они используют энергию гидролизаАТФ для транспорта меди в восстановленной форме Cu(I) из цитозоля черезклеточные мембраны, таким образом, вызывая снижение концентрации меди вцитозоле (Arguello et al., 2007; Lutsenko et al., 2007). Перенесенная черезплазматическую мембрану медь может быть либо выведена из организма черезжелчь (в случае ATP7B), либо высвобождена в кровоток для последующегоперераспределения в организме (в случае ATP7A).

Однако АТФазы неприсутствуют постоянно в составе клеточной мембраны (Pase et al., 2004; Nyasaeet al., 2007), а транспортируют медь во внутриклеточные везикулы, которые вдальнейшем сливаются с клеточной мембраной, высвобождая медь. МедныеАТФазы также осуществляют доставку медь к различным секреторнымкупроэнзимам, таким как ЦП, PAM и другие (Steveson et al., 2003; Gupta andLutsenko, 2009). Процесс доставки меди и встраивания ее в активный центрфермента до конца не изучен. Так, апо-ЦП получает медь от ATP7B, причемвысвобождаемая АТФазой медь встраивается в активный центр полностьюсформированного фермента путем свободной диффузии (Hellman et al., 2002).

Вслучае купроэнзима СОД3, получающего медь от ATP7A, взаимодействиетранспортера и акцептора может стимулировать высвобождение меди из АТФазыи последующее встраивание в активный центр белка-акцептора (Qin et al., 2006).ATP7A и ATP7B представляют собой мембранные белки с молекулярнымвесом 160 – 170 кДа. Они состоят из 8 трансмембранных сегментов и несколькихцитозольных доменов. N-концевой цитозольный домен содержит 6 сайтов длясвязывания меди. Оба белка располагаются на мембране транс-сети аппарата27Гольджи (транс-АГ), где получают медь от шаперона ATOX1. Процесс передачимеди сопровождается гидролизом АТФ, что приводит к конформационнымизменениям АТФаз, вследствие чего медь оказывается ориентированной впросвет АГ, либо его везикул.

Под действием низкого pH происходитвысвобождение меди, сопровождающееся возвращением АТФазы к изначальномусостоянию (Linz and Lutsenko, 2007). Аминокислотные последовательностиATP7A и ATP7B гомологичны на 60%, что объясняет структурное ифункциональное сходство этих белков.Исследования на поляризованных эпителиальных клетках, а такжеклеточных линиях Caco-2 и MDCK, показали, что в ответ на повышение уровнявнутриклеточной медь, ATP7A мигрирует из транс-АГ к базолатеральнойклеточной мембране, предположительно для экскреции меди в кровоток(Greenough et al., 2004; Monty et al., 2005). В то же время, ATP7B мигрирует капикальной мембране клетки, что необходимо для экскреции меди в желчь изгепатоцитов, либо в молоко из клеток молочной железы (Roelofsen et al., 2000).Мутации в генах, кодирующих ATP7A и ATP7B, приводят к развитиюболезни Менкеса и Вильсона, соответственно. При этом болезнь Менкесахарактеризуется дефицитом меди, а болезнь Вильсона – ее накоплением (Keen etal., 1998; Das and Ray, 2006; Gupta and Lutsenko, 2009; Huster, 2010).1.1.3.

Гомеодинамика меди и медь-зависимый сигналингИзвестно, что медь принимает участие в процессах сигналинга. В цитозолепулом “регуляторной меди”, то есть меди, которая рекрутируется для участия впроцессах сигналинга, неоваскуляризации и опухолевой трансформации, можетбыть медь, связанная или с МТ (Vasak and Meloni, 2011), или с COMMD1 (de Bieet al., 2005). В таблице 1.3 представлены белки, принимающие участие вгомеодинамике меди и медь-зависимом сигналинге.28Таблица 1.3.

Белки, контролирующие гомеодинамику меди или участвующие вмедь-зависимом сигналингеБелокЛокализацияФункцияМеталлотионеины* (МТ1 и МТ2, )Цитозоль всехорганизмов,митохондриальныйматрикс,нуклеоплазма,сыворотка кровиЦитозоль инуклеоплазмагепатоцитов идругих клетокДетоксицируют тяжелыеметаллы и АМК**, депонируютCu1+ и Zn2+ и поддерживают ихбаланс, контролируют апоптоз,защищают клетки от гибели инеоплазииСвязывает ионы Cu2+ иэкскретирует их через желчь,участвует в Cu-зависимомсигналинге и регуляцииактивности транскрипционногофактора NF-BИнгибитор каспазы 3,убикитин-лигаза в отношенииCOMMD1, регулятор уровнямеди в клеткеПринимают Cu1+ от СОХ17,участвуют в сборке ЦО,контролируют баланс медиCOMMD1* (белокметаболизмамеди, кодируемыйинтроном генаMURR1)XIAP* (Хсцепленныйингибиторапоптоза)SCO1/SCO2*(супрессорынулевой мутациигена Сох17)SCC* (маленькийпереносчик меди)халькофор*, ***(переносчик меди)Sp1*ЦитозольLOXP(1-4) *(лизилоксидазоподобные белкиЦитозоль, ядроMAC1***Цитозоль, ядроACE1***Цитозоль, ядроВнутренняямембранамитохондрийКровь и мочаЦитозоль, матриксмитохондрийЦитозоль, ядроЭкскретирует ионы меди изпечениТранспортирует медь междуцитозолем и митохондриямиТранскрипционный фактор,повышает активность генаCTR1 при низкой концентрациимеди и понижает принакоплении меди в цитозолеТранскрипционные факторы,контролируют активностьгенов, связанных сгомеодинамикой меди(супрессоры и активаторыроста опухолей иметастазирования)Транскрипционный фактор,повышает активность генаCTR1 при низкой концентрациимеди в клеткеТранскрипционный фактор,повышает активность геновметаллотионеина при высокойконцентрации меди в клеткеДефекты,развивающиесявследствие егодефицитаСнижение содержанияМТ1 и МТ2 ведет кнарушениямтранскрипции,трансляции, продукцииАТФ и др.Накопление меди впечени (медныйтоксикоз собак)Дисбаланс контроля надклеточным цикломНарушение сборки ЦО,дефицит АТФНайден у больныхболезнью ВильсонаНе описаноНарушение гемопоэза,биогенеза митохондрий,созревания коллагена,неоваскуляризацииРазвитие опухолей,активацияметастазированияДефицит медиМедный токсикоз* обнаружены у млекопитающих; ** активные метаболиты кислорода; *** у млекопитающих необнаружены, найдены у дрожжей.29Металлотионеин (МТ) – низкомолекулярный (7 кДа), богатый цистеиномбелок, способный связывать ионы металлов (Pulido et al., 1966; Bremner andDavies, 1975; Palacios et al., 2011).