Диссертация (Роль надпочечников в регуляции метаболизма меди в печени), страница 9

Поликлональные кроличьи антитела,взаимодействующие с белком СОД1 (продукт ~17 кДа) крысы, мыши ичеловека.Ксубъединице4Поликлональныецитохром-с-оксидазыкроличьиантитела,(“Abcam”,Великобритания).взаимодействующиесмитохондриальным белком COX4 (продукт ~17 кДа) крысы, мыши, человека,шпорцевойлягушки,картофеля,африканскойзеленоймартышкиикитайского хомячка.Вторые антитела против IgG кролика (“Abcam”, Великобритания).Поликлональные козлиные антитела к IgG кролика, конъюгированные спероксидазой хрена.46Вторые антитела против IgG козла (“Santa Cruz Biotechnology”, США).Поликлональные ослиные антитела к IgG козла, конъюгированные спероксидазой хрена.Лиофилизированная сыворотка крови козла, иммунизированного гаммаиммуноглобулинами кролика (Институт эпидемиологии и микробиологии им.Н.

Ф. Гамалеи, Москва).Реагентынеорганические соли (“Merck”, Германия)кислоты и щелочи (“Вектон”, Россия)агароза типа V, легкоплавкая агароза, сахароза, Трис, Mmlv обратнаятранскриптаза, Taq-полимераза (“Хеликон”, Россия)ПЦР-буфер (“АмплиСенс”, Россия)смесь dNTP (“Promega”, США)ДНК-маркеры (“Сибэнзим”, Россия)орто-дианизидин (“Serva”, Германия)ферроцин (“Fluka”, Германия)нитротетразолий синий, белковые маркеры молекулярного веса (“BioRad”,США)Tween-20, Тритон Х-100 (“Applichem”, Германия)нитроцеллюлозная мембрана Amersham Hyperfilm ECL, детекционнаясистема Amersham ECL Western Blotting System, рентгеновская пленкаHyperfilm ECL, полоски для изоэлектрофокусирования DryStrip (“GEHealthcare”, США)реактивдлявыделениятотальнойРНКВеликобритания)коктейль ингибиторов протеаз (“Sigma”, США)“TRIzol”(“Invitrogen”,472.3.

Лабораторные животныеРабота выполнена на крысах линии Вистар, полученных из питомника“Рапполово” (Ленинградская область, Россия), а также их потомстве, полученномв виварии НИИ Экспериментальной медицины. Крыс содержали на деревяннойстружке в пластмассовых клетках площадью 1815 см2 или 720 см2.

В большихклетках содержали по 5 – 6 взрослых особей, в маленьких – по 1 самке спотомством. Животные получали стандартный корм и воду без ограничения.Температуру воздуха в помещении, где содержались крысы, поддерживали науровне 22 – 25 °C, влажность составляла 60%, световой режим сменялся черезкаждые 12 часов. В экспериментах было задействовано 50 взрослых крыс и 110новорожденных крыс разного возраста.С лабораторными животными обращались в соответствии с “ЕвропейскойКонвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментовили в иных научных целях” (ETS №123 от 18.03.1986, Страсбург, Франция), атакже Поправкой к этой конвенции (ETS №170 от 02.12.2005). Исследованиябыли одобрены Этическим комитетом НИИ Экспериментальной медицины(протокол №2/13 от 27.06.2013).Удаление надпочечников у взрослых животных проводили под легкимэфирным наркозом через два пояснично-спинных надреза.

Для поддержаниясолевого баланса адреналэктомированные крысы (АЭ крысы) получали безограничения раствор, содержащий 1% глюкозы, 1% NaCl и 0.5% KCl.Контрольная группа состояла из ложно-оперированных крыс (ЛО крысы) –животных подвергали хирургическому вмешательству, которое переносили АЭкрысы, но надпочечники идентифицировали и оставляли in situ. На 10-ый деньпосле операции проводили декапитацию животных и осуществляли забор крови иорганов. Кровь собирали из шейных сосудов крыс и оставляли до образованиясгустка. Далее сыворотку отбирали, очищали центрифугированием при 5000×g втечение 10 минут, замораживали и хранили при -20 °C.

Забор органовпроизводили на льду, после чего образцы замораживали и хранили при -80 °C.482.4. Методы исследования2.4.1. Экспериментальные методыВыделение тотальной РНКТотальную РНК выделяли с помощью коммерческого реактива “TRIzol”(TriPure Isolation Reagent), в соответствии с инструкцией производителя. Навескуткани (около 50 мг) гомогенизировали в 1 мл реактива “TriZol”, затемцентрифугировали в течение 10 минут при 12000×g. К полученному супернатантудобавляли 200 мкл хлороформа, пробирку аккуратно переворачивали 15 раз иоставлялина15минутприкомнатнойтемпературе.Далеесмесьцентрифугировали при 12000×g в течение 15 минут, после чего аккуратноотбирали прозрачную верхнюю фазу, содержащую РНК.

К полученному растворудобавляли500мклизопропанола,послечегосодержимоепробиркиперемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут.Далее, осадок, полученный после центрифугирования смеси при 12000×g втечение 10 минут, промывали 1 мл ледяного 70%-ного этилового спирта. Послеинкубации в течение 5 – 10 минут при комнатной температуре пробуцентрифугировали 7 минут при 7500×g. Полученный осадок высушивали прикомнатной температуре. Далее осадок растворяли в воде, обработаннойдиэтилпирокарбонатом, и измеряли концентрацию РНК. Препараты тотальнойРНК хранили при -70 °С.Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически при длинах волн260 нм и 280 нм, по стандартной методике (Маниатис и др., 1984).

Посоотношению оптических плотностей D260/280 и получаемым спектрам судили очистоте препаратов РНК. О качестве образцов РНК судили также по визуальномупредставлению электрофоретических зон, соответствующих 18S и 28S рРНК,после электрофореза в 1.4% агарозном геле.49Обратная транскрипция, сопряженная с полимеразной цепной реакцией (ОТПЦР)Синтез кДНК с помощью обратной транскрипции (ОТ) проводили в 25 мклреакционной смеси, содержащей 1 мкг тотальной РНК, 200 единиц обратнойтранскриптазы (MMlv), 1 мкМ смеси случайных праймеров, эквимолярную смесьчетырех dNTP по 500 мкM каждого, однократный буфер для обратнойтранскриптазы и 25 единиц ингибитора РНКаз.

Перед добавлением винкубационную смесь, РНК отжигали с праймерами в течение 5 минут при 70 °С.Реакцию проводили в течение 1 часа при 37 °С.ПЦР проводили в 30 мкл смеси, содержащей 1 мкл синтезированной кДНК,1.5 единицы рекомбинантной Taq-полимеразы, эквимолярную смесь четырёхdNTP по 150 мкМ каждого, однократный ПЦР-буфер, содержащий 3 мМ Mg2+, ипо 25 пМ каждого из пары специфических праймеров.

Подбор праймеровосуществлялся с помощью он-лайн приложений “BLAST” и “Primer-BLAST” насайте NCBI (National Center for Biotechnology Information, Национальный центрбиотехнологической информации, США, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/). Специфические температуры, при которых проводили отжиг праймеров(Tan), и нуклеотидные последовательности для каждой пары праймеров приведеныв таблице 2.1. Специфические праймеры были синтезированы фирмой “Синтол”(Россия).Реакцию проводили по следующей схеме:начальная денатурация: 94 °C, 5 минут;циклы синтеза:денатурация: 94 °C, 1 минута;отжиг праймеров: Tan, 1 минута;элонгация: 72 °C, 1 минута;финальная элонгация 72 °C, 7 минут.Для каждой используемой пары праймеров определяли количество цикловнасыщения ПЦР и при постановке эксперимента выбирали такое количествоциклов, при котором насыщения не наступало.

Для праймеров к β-актину числоциклов составляло 28, для остальных праймеров – 30.50Таблица 2.1.Праймеры, использованные для проведения ПЦР-анализа.Названиегена1-actinCpГФИ-CpCp(2-4)Ctr1Ctr2Atp7aAtp7bSod1CcsCommd1Cox4i1Mt1aРазмерПоложениеНуклеотидная последовательность (5'→3')продуктаTan (C)(н.п.)23прямойgaa gat cct gac cga gcg tgобратныйagc act gtg ttg gca tag agпрямойобратныйпрямойобратныйagt aaa caa agt cac aac gag gaa ttcg tat tcc act tat cac caa ttt aagt aaa caa agt cac aac gag gaa tctc ctt ggt aga tat ttg gaa taa aпрямойcaa agc tga agt tgg aga caa agt tобратныйaga ttt tca tcc ac caca gag aac aпрямойtgc cta tga cct tct act ttg gобратныйatg aag atg agc atg agg aagпрямойgag gct gtg ctt ctc ttt gat tобратныйпрямойобратныйпрямойобратныйпрямойgag cct gta gaa tcc tgg tct ggaa gcc tac ttt ccc ggc tac aac aga agcagg tac cca agg ttt cag tgt cca gct cccag aag tac ttt cct agc cct agc cct agc aag cccc acc aca gcc aga acc ttc ctg agaca ata cac aag gct gta cca ctg cag gобратныйtca tct tgt ttc tcg tgg acc acc ata gпрямойcag tct ggt tgt tga tga ggg aga agобратныйact gaa taa cct gac agg agg ctc tgпрямойобратныйgag ggg aat tct caa gtc tat tgcctc aga ttc ccg tcc act tct cпрямойaag aga gcc att tct act tcg gtg tgобратныйcag gct ctc act tct tcc att cat tcпрямойcga ctg cct tct tgt cgc tta cac cобратныйtca cat gct cgg tag aaa acg ggg t45327593985743657390603585720360421643326522062265603076048460350585112Mt2aTfTfrcFth1Ftlпрямойcga tct ctc gtt gat ctc caaобратныйggc tag gtt cct acg ttg tttпрямойctg caa gtt cga tga att ttt cag tобратныйagt ctt cct gct tca gat cct tag cпрямойagg aac cag acc gct aca ttg taобратныйaat gta agt gaa agc ctt tag atg caaпрямойgac agt gct tga acg gaa ccc ggt gобратныйtct tca ggg cca cat cat ccc ggt cпрямойtcg tca gaa tta ttc cac cga agtобратныйggt ttt aсс cca сtc atc ttg agaпрямойPam3обратныйctt tgt cat ggt ttc cag gat ttat atg aaa tgg caa aga cat tcc t45276562515925759279622655928960Для селективного выявления мРНК секреторного ЦП и мРНК, кодирующейГФИ-ЦП, использовали общий прямой праймер и различные обратные праймеры.При дизайне праймеров основывались на данных о механизме формированияальтернативных форм ЦП-мРНК (Patel et al., 2000).

Праймер Cp(2-4),подобранный на 2 – 4 экзоны гена Cp, обнаруживает как секреторный ЦП, так иГФИ-ЦП.Электрофоретический анализ ПЦР продуктов проводили в 1.4% агарозномгеле на TBE буфере (0.089 М Tris-HCl, 0.089 M борная кислота, 0.002 М ЭДТА,pH 8.0) в камере для горизонтального электрофореза (Sambrook et al., 1989). Длявизуализации нуклеиновых кислот в гель добавляли бромистый этидий. Вкачестве маркера использовали набор из 10 фрагментов ДНК длиной от 100 до1000 н.п. Гели просматривали на УФ-трансиллюминаторе и фотографировали нацифровую камеру для последующего анализа.При использовании всех перечисленных праймеров в приведенныхусловиях синтезировались только ПЦР продукты вычисленного размера (Рис.2.1).Дляполуколичественнойхарактеристикиэкспрессиигеновмедьтранспортных белков и купроэнзимов использовали соотношение междуквазистационарным уровнем мРНК исследуемого гена и мРНК β-актина, который52экспрессируется в печени и надпочечниках крыс разного возраста примерно наодинаковом уровне так, что доля его мРНК от тотальной мРНК примерноодинакова (Marone et al., 2001).Рис.

2.1. Пример протокола ОТ-ПЦР анализа.Электрофорез амплификатов, полученных на тотальной РНК, выделенной из надпочечниковвзрослых крыс: 1 –  -actin, 2 – Ctr1, 3 – Ctr2, 4 – Аtp7a, 5 – Sod1, 6 – Ccs, 7 – Commd1, 8 – Mt1a,9 – ГФИ-Cp, 10 – Cox4i1, 11 – Pam, 12 – маркеры.Денситометрический анализ электрофоретических гелей осуществляли спомощьюкомпьютерныхпрограмм“ScionImage”(http://scion-image.software.informer.com/) и “ImageJ” (http://imagej.nih.gov/ij/).