Диссертация (Роль надпочечников в регуляции метаболизма меди в печени), страница 10

Результатыанализавыражаливусловныхединицахкакотношениеколичестваобразовавшегося ПЦР-продукта на данной мРНК к количеству ПЦР-продукта актина, полученного на этих же препаратах РНК в этих же опытах. В работеприведены средние значения из трех и более независимых экспериментов.ВыделениесубклеточныхфракцийметодомдифференциальногоцентрифугированияДляполучениясубклеточныхфракцийобразцытканибылигомогенизированы в буфере H, содержащем 250 мМ сахарозы, 100 мМ KCl, 5 мМMgCl2, 10 мМ Трис-HCl (pH 7.4), 5 мМ ДТТ и 0.5 мкл/мл коктейля ингибиторовпротеаз.

Гомогенаты последовательно центрифугировали 2 раза в течение 10минут при 800×g для очистки от ядер и фрагментов клеточных мембран.Супернатант центрифугировали в течение 20 минут при 12000×g. Осадок,содержащиймитохондриальнуюфракцию,ресуспендироваливгомогенизирующем буфере (ГБ) с добавлением к нему 2% тритона X-100,53инкубировали в течение 20 минут на льду, после чего центрифугировали втечение20минутпри17000×g.Полученныйосадок,содержащиймитохондриальную фракцию, ресуспендировали в ГБ.Для выделения цитозольной фракции, постмитохондриальный супернатанточищали центрифугированием при 17000×g в течение 1 часа.ПолучениесубклеточныхфракцийметодомравновесногоультрацентрифугированияГомогенизацию образцов печени проводили в ГБ, как описано ранее.

Далеегомогенаты пропускали через 6 слоев марли для очистки от неразрушенныхфрагментов ткани, после чего центрифугировали в течение 10 минут при 800×g.Полученный осадок состоял из ядер из фрагментов клеточных мембран. Для тогочтобы оценить распределение меди между ядрами и фрагментами мембран,осадки ресуспендировали в ГБ, отбирали аликвоту для измерения концентрациимеди, после чего оставшееся количество материала наслаивали на 1.5 Мсахарозную подушку и центрифугировали в течение 2 часов при 15000×g. Осадки,содержащие ядра, собирали, ресуспендировали, в них измеряли концентрациюмеди, которую выражали в процентах от общего содержания меди во фракции,седиментировавшей при 800×g.

Грубая митохондриальная фракция былаполучена как осадок от центрифугирования постъядерного супернатанта при12000×g в течение 20 минут.Для разделения митохондрий, лизосом и пероксисом полученный осадокресуспендировали в ГБ и нанесли на ступенчатый градиент сахарозы (27–42–45–47–50%), после чего центрифугировали при 58000×g в течение 5 часов наультрацентрифуге Optima LE-80K, ротор SW27. После центрифугирования изградиента отобрали фракции объемом по 1 мл, в которых плотность сахарозыизмерили рефрактометром.Фракция, отобранная на границе 45% сахарозы (плотность 1.18 – 1.19 г/см3),включает митохондрии; материал, собранный на границе 47% сахарозы(плотность1.20г/см3),соответствуетлизосомальнойфракции;фракция,54собираемая на границе 50% сахарозы (плотность 1.22 г/см3), содержитпероксисомы.

Полученные фракции митохондрий, лизосом и пероксисом развелив 4 раза ГБ, центрифугировали при 15000×g в течение 30 минут, после чегоотобрали осадки. Фракция, содержащая внутриклеточные мембраны, былаизолирована из постмитохондриального супернатанта центрифугированием при23000×g в течение 1 часа. Супернатант последнего центрифугированияпредставлял собой цитозольную фракцию.Все полученные фракции лизировали в смеси 5% ДСН и 1% NaOH (1:4 v/v),прогревали до полного растворения материала, после чего в полученных пробахизмеряли концентрацию общего белка и содержание меди.Определение содержания митохондриальной ДНК (мтДНК)Для определения содержания мтДНК очищенные препараты митохондрий ицитозоля печени (20 мкг белка) лизировали в 30 мкл буфера, включающего 20мкМ ДТТ, 1.7 мкМ ДСН и 0.05 мкг/мкл протеиназы К.

Далее пробы влизирующей смеси инкубировали в течение 2 часов при 55 °C. После инкубации к23 мкл лизированной смеси добавляли 7 мкл ПЦР-смеси, включавшей 1.5единицы рекомбинантной Taq-полимеразы, эквимолярную смесь четырёх dNTPпо 200 мкМ каждого, однократный ПЦР-буфер, содержащего 3 мМ Mg2+, и по 25пМкаждогоизпарыспецифическихпраймеров.Последовательностиспецифических праймеров, подобранных для амплификации митохондриальнойДНК приведены в таблице 2.2.Таблица 2.2.Праймеры, использованные для выявления мтДНКПоложениеНуклеотидная последовательность (5'→3')прямойggt tct tac ttc agg ggc cat cобратныйgtg gaa ttt tct gag ggt agg cРазмер продукта (н.п.)Tan (C)5186255Амплификацию, электрофорез амплификатов, а также денситометрическийанализ полученных гелей проводили, как описано выше.

Число цикловамплификации составляло 25.Для амплификации был выбран регуляторный участок мтДНК – D-петля.Это вариабельный участок митохондриального генома, не имеющий аналогов вядерном геноме (Рис. 2.2).Праймеры амплифицируют участок мтДНК от 15785 по16299 н. тяжелой цепи мтДНК.Рис. 2.2. Положение амплифицируемого участка на мтДНК.Гель-фильтрацияГель-фильтрацию образцов цитозоля печени (2 мл, содержание общегобелка 20 мг/мл) проводили на колонке (10 – 40 мкм, 1.640 см) с Сефадексом G75в 20 мМ Трис-HCl буфере (pH 7.6), содержащем 5 мМ 2-меркаптоэтанол.Скорость элюции составляла 0.5 мл/мин.Образцы сыворотки крови были фракционированы на такой же колонке вфосфатно-солевом буфере (PBS), pH 7.4.

Свободный объем колонки оценивали с56помощью декстранового синего. Фракции, следовавшие за свободным объемом,собирали (1.5 мл) и измеряли в них оптическую плотность при длинах волн 280 и254 нм и концентрацию меди.Электрофоретическое разделение белковЭлектрофоретическое разделение белков проводили в полиакриламидномгеле (ПААГ) 8%, 10% или 15% в зависимости от молекулярной массыисследуемого белка, в неденатурирующих условиях, либо с добавлением 1%додецилсульфатанатриянеденатурирующегохромогеннымиисследуемых(ДСН)электрофорезасубстратамибелков.Последля(Laemmli,геливыявления1970).ПослеокрашивалиспецифическимиферментативнойДСН-электрофорезабелкиокончанияактивностипереносилинанитроцеллюлозную мембрану (НЦМ) для последующего анализа методомиммуноблотинга.ИммуноблотингПеренос белков на НЦМ осуществляли в системе для “мокрого”электропереноса Mini Trans-Blot при постоянной силе тока 350 мА в течение 1часа.

Качество электропереноса и равномерность нанесения проб на дорожкиконтролировали окрашивание Понсо S. Для денситометрического анализа,окрашенную Понсо S НЦМ сканировали, тонкую горизонтальную полосу,соответствующую примерно 50 кДа, использовали для нормализации (Aldridge etal., 2008).НЦМ отмывали от Понсо S раствором PBS, содержащим 0.2% Tween-20(PBST). Далее проводили неспецифическую забивку НЦМ раствором BLOTTO(5% раствор обезжиренного молока, приготовленный на PBST) в течение ночипри 4 °С. После забивки НЦМ инкубировали с первыми антителами в течение 1часа либо в течение ночи, при 4 °С. Отмывку НЦМ от первых антител проводили3 раза по 5 минут раствором PBST, после чего НЦМ в течение 1 часа при 4 °Синкубировали со вторыми антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена,57и отмывали аналогично описанному ранее.

Иммунные комплексы выявлялиметодом усиленной хемилюминесценции с использованием системы AmershamECL Western Blotting System. Полученные рентгеновские пленки сканировали иподвергали денситометрическому анализу.Ракетный иммуноэлектрофорезСодержание иммунореактивных полипептидов белка ЦП определяли припомощи ракетного иммуноэлектрофореза (Kroll, 1973). Агарозный гель (1%),содержащий 400 мг/мл специфических антител к ЦП готовили на электродномбуфере, содержащем 187 мМ Трис, 374 мМ глицина, 5.6 мМ барбитала, 32 мМбарбитала натрия, pH 8.8. В лунки наносили аликвоты сывороток крови взрослыхкрыс объемом 1.5 мкл, либо аликвоты сывороток новорожденных крыс объемом 3мкл.Электрофорез проводили в течение ночи при постоянном напряжении 10V/см геля, при 10 – 15 °C.

Далее гели отжимали и высушивали. Иммунные зонывизуализировали при помощи окрашивания орто-дианизидином. Площадь пикапреципитации измеряли как площадь равнобедренного треугольника. Каждаяпластинка геля содержала лунки, в которые в качестве количественныхстандартов добавляли растворы ЦП крысы (A610/A280=0.045) с известнымиконцентрациями.Двумерный электрофорезДвумерный электрофорез проводили в соответствии с протоколом,разработанным Нарыжным С.Н. (Naryzhny and Lee, 2001; Naryzhny and Lee, 2003).Препараты митохондриальных фракций, содержащие 80 мкг белка растворяли вдвукратном объеме лизирующего буфера, содержащего 7 М мочевину, 2 Мтиомочевину, 4% CHAPS, 1% ДТТ и коктейль ингибиторов протеаз. В первомнаправлении электрофореза белки разделяли изоэлектрофокусированием (ИЭФ),используя полоски DryStrip kit длиной 7 см.

Образцы в лизирующем буфересмешивали с регидратирующим буфером, содержащим 7 М мочевину, 2 М58тиомочевину, 2% CHAPS, 0.3% ДТТ, 2% IPG буфер (pH 3 – 11) и 0.001%бромфенол голубой, в конечном объеме 130 мкл. Полоски регидратировали вуказанной смеси при 4 °C в течение 4 часов.ИЭФ вели при 20 °C в аппарате Multiphore II по программе: 10 минут при300 V, затем 1.5 часа при линейном градиенте от 300 V до 3500 V и далее 2 часапри 3500 V.

Перед проведением электрофореза во втором направлении полоскивымачивали 2 раза по 10 минут в уравновешивающем растворе (50 мМ Трис-HCl,pH 6.8, 6 М мочевина, 2% ДСН и 30% глицерин), содержащем сначала 1% ДТТ, азатем 5% иодацетамид. Далее каждую полоску помещали сверху на ПААГвторого направления и закрепляли 1 мл раствора 0.5% агарозы, приготовленнойна трис-глициновом электродном буфере (25 мМ Трис, pH 8.3, 200 мМ глицин и0.1% ДСН). Денатурирующий электрофорез второго направления вели, используясистему miniVE, в 12% ПААГ размером 89 см, при комнатной температуре,постоянном токе 25 мА/гель и напряжении 100 – 160 V в течение 1.5 часов.После завершения электрофореза ПААГ отмывали от ДСН и фиксировали 2раза по 15 минут в растворе 25% изопропанола с 10% уксусной кислотой.

Далеебелки в геле визуализировали окрашиванием нитратом серебра по методуShevchenko с соавторами, модифицированному Winkler с соавторами (Shevchenkoet al., 2006; Winkler et al., 2007). Гель после фиксации ополаскивали в воде втечение 10 минут, после чего обрабатывали раствором тиосульфата натрия (0.2г/л) в течение 1 минуты. Гель промывали водой 2 раза по 20 секунд иинкубировали в течение 30 минут в растворе нитрата серебра (2 г/л).