Диссертация (Роль надпочечников в регуляции метаболизма меди в печени)

Федеральное государственное автономное образовательноеучреждение высшего образования“Санкт-Петербургский государственный политехнический университет”Федеральное государственное бюджетное учреждение“Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины”Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наукНа правах рукописиЗатуловская Юлия АлександровнаРОЛЬ НАДПОЧЕЧНИКОВ В РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМАМЕДИ В ПЕЧЕНИ03.01.04 – биохимияДиссертация на соискание ученой степеникандидата биологических наукНаучный руководитель:доктор биологических наук,профессорЛ.В.

ПучковаСанкт-Петербург20142СОДЕРЖАНИЕСПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ....................................................................................... 4ВВЕДЕНИЕ ................................................................................................................. 51. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ....................................................................................... 121.1. Биологическая роль меди ................................................................................. 121.1.1.

Купроэнзимы .............................................................................................. 121.1.2. Транспортная система меди ...................................................................... 201.1.3. Гомеодинамика меди и медь-зависимый сигналинг ................................ 271.2. Эмбриональный и взрослый типы метаболизма меди ...................................

321.3. Надпочечники ................................................................................................... 351.6.1. Строение надпочечников ........................................................................... 351.6.2. Гормоны надпочечников ........................................................................... 381.6.3. Место надпочечников в общем метаболизме меди у млекопитающих .. 412.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ............................................................................... 442.1. Оборудование ................................................................................................... 442.2. Материалы ........................................................................................................ 452.3. Лабораторные животные ................................................................................. 472.4.

Методы исследования ...................................................................................... 482.4.1. Экспериментальные методы ...................................................................... 482.4.2. Компьютерные методы .............................................................................. 612.4.3. Статистическая обработка результатов ....................................................

613. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ .................................................................... 623.1. Влияние адреналэктомии на метаболизм меди у крыс .................................. 623.1.1. Изменения статуса меди в сыворотке крови крыс после АЭ................... 623.1.2. Изменение концентрации меди в органах и субклеточных фракцияхпечени АЭ крыс ................................................................................................... 663.1.3. Влияние АЭ на распределение меди в цитозоле гепатоцитов .................

683.1.4. Исследование митохондриальной фракции гепатоцитов АЭ иконтрольных крыс ................................................................................................ 773.1.5. Влияние АЭ на гетерогенность популяции митохондрий печени крыс . 8133.1.6. Исследование транскрипционной активности генов, кодирующих белкиМСМ, в печени АЭ крыс ..................................................................................... 853.2.

Характеристика метаболизма меди в надпочечниках .................................... 923.2.1. Концентрация меди в печени и надпочечниках крыс в период раннегопостнатального развития ..................................................................................... 923.2.2. Статус меди в сыворотке крови крыс в период раннего постнатальногоразвития ................................................................................................................ 963.2.3. Изменение профилей экспрессии генов, ассоциированных сметаболизмом меди, в течение онтогенеза .......................................................

1003.2.4. Содержание белков, участвующих в метаболизме меди, в печени инадпочечниках крыс в течение раннего онтогенеза ........................................ 1083.2.5. Схемы метаболизма меди в гепатоцитах и надпочечниках крыс .......... 1114. ЗАКЛЮЧЕНИЕ .................................................................................................. 1165. ВЫВОДЫ ............................................................................................................ 123СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ....................................................................................

1244СПИСОК СОКРАЩЕНИЙААС – атомная абсорбционная спектроскопияАГ – аппарат ГольджиАКТГ – адренокортикотропный гормонАТФ – аденозинтрифосфатАФК – активные формы кислородаАЭ – адреналэктомияАЭ-крысы – адреналэктомированные крысыВТММ – взрослый тип метаболизма медиГФИ-ЦП–церулоплазмин,связанныйсмембранойгикозилфосфатидилинозитоловый якорьДСН – додецилсульфат натрияДТТ – дитиотреитолЛО-крысы – ложнооперированные крысыМСМ/ТСМ – метаболическая/транспортная система медиМТ – металлотионеинМЭ – β-меркаптоэтанолн.п. – нуклеотидная параНЦМ – нитроцеллюлозная мембранаПААГ – полиакриламидный гельСОД – супероксиддисмутазаЦП – церулоплазминЦО – цитохром с оксидазаЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислотаЭПР – эндоплазматический ретикулумЭТММ – эмбриональный тип метаболизма медиАТР7А/АТР7В – соответственно АТФаза Менкеса и АТФаза ВильсонаРАМ – пептидилглицин α-амидирующая монооксигеназаPBS – фосфатно-солевой буферчерез5ВВЕДЕНИЕАктуальность темы исследования и степень ее разработанностиПо классификации элементов живого медь входит в группу микроэлементови является одновременно обязательным компонентом всех организмов итоксическим агентом.

Незаменимость меди для млекопитающих обусловлена тем,что она является каталитическим и структурным ко-фактором ферментов,контролирующих базовые метаболические процессы аэробов (Tapiero et al., 2003).Осуществление каталитических функций меди связано с изменением состоянияокисления Cu(I)↔Cu(II). Активные центры купроэнзимов имеют высокоаффинные сайты связывания атомов меди с большим координационным числом.Они прочно удерживают медь в обоих состояниях окисления (Rubino and Franz,2012). Вне координационных сфер ионы меди индуцируют образованиесвободных радикалов кислорода, которые, действуя подобно ионизирующемуизлучению, вызывают окислительный стресс (Kozlowski et al., 2014).

Извнеклеточной среды к местам формирования купроэнзимов медь безопаснодоставляетсяразличнымспомощьюсемействам,медь-транспортныхотносятсякбелков.интегральнымОнипринадлежатмембранным,илирастворимым, белкам, расположены в плазматической мембране, цитозоле,митохондриях, аппарате Гольджи, лизосомах (Nevitt et al., 2012). Медьтранспортные белки содержат разнообразные Cu(I)-связывающие мотивы: смаленьким и большим координационным числом, с высокой и низкойаффинностью, с различной комбинацией лигандов. Каждый из них удерживаетатом меди, но при локальном изменении окислительно-восстановительногопотенциала или рН среды, в присутствии другого транспортера меди в апо-формеили апо-купроэнзима, атом меди может быть легко передан.

Передача медипроисходит при прямом специфическом взаимодействии транспортеров внаправлении снижения энергии связывания. Медь, теряемая в результатеврожденных дефектов транспортеров или активных центров купроэнзимов,6аккумулируетсявклеткахипровоцируетразвитиеонкологическихинейродегенеративных заболеваний (Gaggelli et al., 2006).Биологическая роль меди не ограничивается участием в биокатализе.Внутриклеточные и внеклеточные локальные изменения концентрации медиконтролирует сигнальные пути (Mufti et al., 2007; Turski et al., 2012; Ioannoni et al.2012; Bartuzi et al., 2013), модулируют работу рецепторов эндотелиальногофактора роста, γ-аминомасляной кислоты и глутамата, способствуют работепотенциал-управляемого Ca(II)-канала (Finney et al., 2007; Gaier et al., 2013).Таким образом, медь можно отнести к вторичным мессенджерам.

Выполнениеэтой функции требует двух условий: (1) существование медь-регулируемыхсенсоров и (2) наличие пула меди, который аккумулирует и легко освобождает ее.У млекопитающих к медь-регулируемым сенсорам относятся транскрипционныйфактор Sp1 (Liang et al., 2012) и семейство лизилоксидаза-подобных белков(LOXL1-4), дисбаланс функции которых приводит к ускорению роста опухолей(Nishioka et al., 2012). Контроль над локальными изменениями концентрациивнутриклеточной меди обеспечивает (металлотионеин/глутатион/COMMD1)система, которая связывает медь и затем распределяет ее между купроэнзимами,депонирует, или способствует выведению (Vasak and Meloni, 2011; Fedoseienko etal., 2014).

Изменение уровня содержания меди во внеклеточной среде зависит отактивности гена церулоплазмина в печени – центральном органе метаболизмамеди: вся абсорбированная в кишечнике медь поступает в печень, в нейвключается в секреторный церулоплазмин или выводится через желчь.Периферические органы, нуждающиеся в меди, через факторы, природа которыхостается не известной, индуцируют освобождение меди из печени в кровоток(Kim et al., 2010; Babich et al., 2013).

С другой стороны, немногочисленныеданные литературы показывают, что адреналэктомия задерживает экскрециюмеди в желчь (Gregoriadis and Sourkes, 1970; Prohaska et al., 1988; Fields et al.,1991), и, возможно, медь в надпочечники поступает по механизму, сходному стаковым в печени (Hanson et al., 2001; Zatulovskiy et al., 2012). Эти фактыпозволяют предположить, что надпочечники контролируют метаболизм меди в7печени, однако, сведения о метаболизме меди в самих надпочечникахотсутствуют.

Изучение метаболизма меди в них и влияние адреналэктомии намолекулярно-генетические механизмы, контролирующие баланс меди в печени,являетсявкладомвобщеепониманиемеханизма,поддерживающегогомеодинамику меди в организме млекопитающих.ЦельЦелью настоящего исследования было изучение влияния, оказываемогонадпочечниками на метаболизм меди в печени, и особенностей метаболизма медив печени и надпочечниках в течение постнатального развития.Задачи1.Оценить изменение показателей статуса меди в сыворотке крови крыс послепроведения адреналэктомии (АЭ).2.Сравнить метаболизм меди в печени контрольных и адреналэктомированныхкрыс: определить концентрацию и внутриклеточное распределение меди вгепатоцитах, оценить активность генов медьтранспортных белков икупроэнзимов на уровне транскрипции, трансляции и ферментативнойактивности.3.Изучить особенности эмбрионального типа метаболизма меди и егопереключения на взрослый тип в печени крыс.4.Охарактеризовать метаболизм меди в надпочечниках крыс на разных срокахонтогенетического развития.Научная новизнаПредставлена детальная характеристика метаболизма меди в организме АЭкрыс.