Диссертация (Роль надпочечников в регуляции метаболизма меди в печени), страница 4

В состав PHM входитион меди. Этот домен катализирует гидроксилирование глицина, находящегося наС-конце многих неактивных форм нейропептидов. На следующем этапесозревания гормона PAL последовательно гидролизует гидроксилированныйпептид, продуцируя амидированный пептид (Eipper et al., 1992; Klinman, 2006).PAMучаствуетвпосттрансляционноймодификациимногихважныхнейропептидов, включая окситоцин, вазопрессин, адренокортикотропный гормон,вазоактивныйинтестинальныйпептид,веществоР,нейропептидY,холецистокинин, гастрин, и многие другие (Eipper et al., 1992; Prohaska andBroderius, 2006).PAM является преимущественно мембраносвязанным или везикулярнымбелком, однако он был обнаружен также в сыворотке крови в виде укороченнойсекретируемой формы белка, лишенной трансмембранного домена (Eipper et al.,1985).

Ранее было показано, что in vitro биохимическая активность PAM снижена20в тканях и сыворотке крови крыс с дефицитом меди (Prohaska et al., 1995).Исследование, выполненное на пациентах с болезнью Менкеса, предлагаетиспользовать содержание PAM в сыворотке крови как параметр для оценкистатуса меди (Prohaska et al., 1997).1.1.2. Транспортная система медиФормирование холо-купроэнзимов полностью зависит от транспорта медииз окружающей среды к местам металлирования апо-купроэнзимов в клетке. Дляэтого медь должна быть перенесена через мембраны и растворимые пространстваклетки (в случае с ЦО ионы меди преодолевают три мембраны и 2 растворимыхпространства). Однако атомы меди, находящиеся вне координационных сфер,являются высокотоксичными агентами, так как способны катализировать реакциитипа Фентена, в результате которых образуются активные метаболиты кислорода,действующие подобно радиационному облучению на все структуры клетки(Yoshida et al., 1993).Проблему безопасного транспорта меди решает специальная системабелков-переносчиков – транспортная система меди (ТСМ), являющаяся частьюметаболической системы меди (МСМ).

У млекопитающих ТСМ, с одной стороны,демонстрирует высокую консервативность и ее белки гомологичны белкам ТСМвсех филогенетических групп, с другой стороны, она состоит из самого большогочисла участников, набор которых и уровень экспрессии характеризуютсятканевой специфичностью и зависят от периода онтогенетического развития.Участники ТСМ млекопитающих приведены в таблице 1.2 и их работа показанана рисунке 1.1. Общим свойством этих белков является наличие медьсвязывающего домена, включающего, как правило, мотив с двумя остаткамицистеина(СХС,илиСХХС),которыеобразуютдвузубыйкластерскоординационным числом 2. Этот мотив с высокой аффинностью связывает Cu(I).Общая длина домена может составлять несколько десятков аминокислотныхостатков, состав которых и взаимное расположение в полипептидной цепи21определяют аффинность всего мотива и его способность принимать/передаватьатом меди.Табл.

1.2. Белки млекопитающих, участвующие во внутриклеточномперемещении медиБелок1CTR1(высокоаффинныйимпортер меди),Cu1+/K1+-обменникОсновное местолокализация, органпреимущественнойэкспрессии2Плазматическаямембрана, всеклеткиФункцияДефекты, развивающиесявследствие утратыфункции гена3Связывает Cu2+ вовнеклеточномпространстве,предположительновосстанавливаетCu2+→Cu1+, переносит Cu1+в цитозоль без затратыэнергии, контролируетморфогенезПереносит Cu1+ изэндолизосомальногопространства в цитозоль4Внутриутробная гибельгомозигот, дефициткупроэнзимов угетерозиготCTR2(низкоаффинныйтранспортер меди)Мембраныэндолизосом всехклетокDMT1 (транспортер2-валентных ионов)Апикальный доменплазматическоймембраныэнтероцитовЦитозоль всехклетокТранспортирует Cu2+ изЖКТ в энтероцитыСнижение поступления ворганизм ионов 2валентных металловПриобретает Cu1+ у CTR1 ивстраивает его в апо-СОД1Дефицит СОД1-активностиCOX17 (Cu1+шаперон для ЦО)МежмембранноепространствомитохондрийПереносит Cu1+ от CTR1 вНарушение сборки ЦО,митохондрии и передаетдефицит производстваего на интегральные белки АТФвнутренней мембранымитохондрий SCO1 и SCO2SCO1 и SCO2ВнутренняямембранамитохондрийHAH1 (или ATX1,или ATOX1, Cu1+шаперон длямедьтранспортныхАТФ-аз)Цитозоль всехклетокВстраивают медь в ЦО,контролируют баланс медив клетке, осуществляютокислительновосстановительный циклCu2+→Cu1+Переносит Cu1+ от CTR1 кцитозольным медьсвязывающим мотивам Cuтранспортных АТФ-аз;компонентантиоксидантной системыцитозоляCCS (Cu1+-шаперондля СОД1)Нарушение транспортажелезаНарушение сборки ЦО,дефицит производстваАТФРанняя пренатальнаягибель, отставание в росте221АТР7А (АТФ-азаМенкеса, Cu1+/Cu2+транспортирующаяАТФ-аза Р1 типа)2Мембраны транссети Гольджи, всеклетки, исключаягепатоцитывзрослыхмлекопитающих3Принимает ионы Cu1+ отНАН1, переносит их вцистернальноепространство комплексаГольджи, окисляя до Cu2+,и встраивает их в активныецентры купроэнзимов вкомплексе Гольджи, но нев секреторный ЦП;участвует в экскрециимеди из клетокАТР7В (АТФ-азаВильсона,Cu1+/Cu2+транспортирующаяАТФ-аза Р1 типа)Мембраны транссети Гольджи,гепатоцитывзрослыхмлекопитающих,молочная железа,некоторые отделымозгаПринимает ионы Cu1+ отНАН1, переносит их вцистернальноепространство комплексаГольджи, окисляя до Cu2+,встраивает их в активныецентры секреторного ЦП,формирующегося вкомплексе Гольджи;экскретирует медь в желчь4Пренатальная и ранняяпостнатальная гибель,гипопигментация,нарушение формированиясинапсов, соединительнойткани, ломкие изакрученные волосы.

Ярковыраженный дефициткупроэнзимов, особенноприобретающих медь всекреторном пути клетки(болезнь Менкеса)Болезнь Вильсона,накопление меди в клеткахпечени и мозга втоксических количествах;дефицит холо-ЦП,нарушение метаболизмажелезамедьтранспортныеATP7A/B АТФазы P-типавнеклеточныйдонор меди илисвободная медьмедныешаперонытранс- ГольджиATOX1секретируемыеи мембранныекупроэнзимы?CCSSOD?GSHMTCOMMD1?CTR1халькофорCOX17CTR2?- Cu(II)- Cu(I)- каталит.

центрыCOXЭндосомыМитохондрияЯдроРис. 1.1. Обобщенная схема транспортной системы меди (ТСМ) клетокпозвоночных животных.Заштрихованными фигурами изображены медь-транспортные белки, темно-серыми –купроэнзимы, светло-серым – известные медь-связывающие молекулы, роль которых в ТСМточно не установлена. Пунктирной линией изображены гипотетические участники и пути ТСМ,молекулярная природа которых на данный момент не установлена. Путь обеспечения медьюCOX показан упрощенно. GSH – глутатион, MT – металлотионеин, COMMD1 – белокCOMMD1/MURR1.23Белки-транспортеры, или Cu(I)-шапероны, образуют цепочки, по которымони, меняя холо-форму на апо-форму, при прямом взаимодействии передаютCu(I) друг другу в направлении повышения аффинности их медь-связывающихмотивов из внеклеточного пространства в различные компартменты клетки. Cu(I)шапероны, которые встраивают медь непосредственно в апо-купроэнзимы,дополнительно содержат домены, связывающиеся с апо-формой этих ферментов.При общем сходстве механизма передачи меди между Cu(I)-шаперонами, ониотносятся к разным типам белков.Белок CTR1 (кодируется геном Slc31a1) является высокоаффиннымтрансмембраннымимпортероммеди,обеспечивающимосновнойпутьпоступления меди в клетки всех типов.

Впервые CTR1 был описан как медьтранспортный белок у дрожжей Saccharomyces cerevisae (Dancis et al., 1994). Былопоказано, что инактивация дрожжевого yCTR1 приводила к снижению импортамеди в клетки и развитию дефицита железа, вследствие низкого насыщения медьюмедь-зависимой ферроксидазы FET3. В 1997 году был выделен hCTR1 человека,белок, способный компенсировать утраченные функции в клетках дрожжей снокаутированными yCTR1 и yCTR3 (Zhou and Gitschier, 1997). Кроме того, погомологии с CTR1 авторами был также обнаружен и впервые клонирован белокCTR2 (Slc31a2) – низкоаффинный транспортер, переносящий медь черезмембрану. Для того, чтобы подтвердить участие CTR1 в импорте меди в клеткахчеловека, клетки линии HEK293 были трансфецированы плазмидой, содержащейоткрытую рамку считывания гена Ctr1 мыши под контролем цитомегаловирусногопромотора.

Импорт меди в клетки, суперпродуцирующие CTR1, возрастал в 3 – 7раз по сравнению с вектор-трансфецированными контрольными клетками (Lee etal., 2002). Также было показано, что объем переноса меди через плазматическуюмембрану зависит от внеклеточной концентрации меди.Белок CTR1 экспрессируется в клетках большинства органов, но наиболеевысокий уровень экспрессии у мышей наблюдается в печени, тонком кишечнике,сердце и почках (Lee et al., 2001; Kuo et al., 2006). Кроме того, синтез CTR1увеличивается в клетках молочной железы во время беременности и в период24лактации. В клетке CTR1 преимущественно встроен в плазматическую мембрану,однако может находиться также в мембране внутриклеточных везикул (Wee et al.,2013).

При повышении уровня внеклеточной меди происходит быстрый эндоцитозипоследующаядеградацияCTR1(Guoetal.,2004).Факторами,способствующими увеличению количества белка CTR1, а также модулирующимиего локализацию, являются гипоксия и низкий pH внеклеточной среды.Мономер CTR1, состоящий из 190 аминокислотных остатков, представленследующими доменами – внеклеточный N-концевой домен, три трансмембранныхдомена и цитозольный С-концевой домен (Рис. 1.2 А) (Kim et al., 2008).Структурные исследования показали,чтоCTR1 функционируетв видегомотримера (Рис.