Диссертация (Роль надпочечников в регуляции метаболизма меди в печени), страница 2

Показано, что АЭ не вызывает изменения уровня экспрессии генов,ассоциированных с обменом меди, но приводит к повышению показателейстатуса меди в сыворотке крыс, накоплению меди в печени, а такжеперераспределению меди между клеточными компартментами гепатоцитов. В8результате нарушается металлирование купроэнзима СОД1, увеличиваетсянагрузка медью белка МТ, выполняющего функцию клеточного депо меди.

АЭвлияет на метаболизм меди в митохондриях, приводя к изменению общегопротеома. Показана неоднородность популяции митохондрий в клетке. Выделенаи очищена фракция митохондрий, седиментирующая с ядерной фракцией. Врезультате АЭ в данной фракции митохондрий происходит снижение отношениямтДНК/COX4.В работе показано, что накопление меди в гепатоцитах крыс в периодэмбрионального типа метаболизма меди начинается в ядрах, однако после 5-годня жизни основная часть меди переносится в митохондриальную фракцию.Метаболизм меди в печени новорожденных крыс, по сравнению с взрослымиживотными,характеризуетсянизкойактивностьюгеновCtr1,Cp,Ccs,отсутствием экспрессии гена Atp7b, ген Mt1a экспрессируется активно.В надпочечниках концентрация меди сразу после рождения начинаетснижаться, и уже к 5-му дню жизни содержание меди достигает значения,характерного для взрослых животных.

Экспрессия генов медьтранспортныхбелков и купроэнзимов соответствует таковой для клеток негепатоцитарныхрядов: и у новорожденных, и у взрослых крыс активен только ген Atp7a, но неAtp7b, активна экспрессия гена Ctr1, ген Cp экспрессируется, но продуцируетсялишь мРНК, кодирующая сплайс-изоформу ЦП (ЦП, заякоренный в мембранучерез гикозилфосфатидилинозитоловый якорь (ГФИ-ЦП)).Теоретическая и практическая значимость работыОписанныеизмененияметаболизмамедиворганизмеАЭкрысподтверждают предположение о том, что надпочечники играют важную роль врегуляции метаболизма меди в печени, а значит, и в целом организме.

Также былиполучены результаты, показывающие особенности метаболизма меди в печени инадпочечниках на ранних этапах онтогенетического развития.Изучениемеханизмов, лежащих в основе этих процессов, представляется важнойфундаментальной задачей. Даже незначительное нарушение в экспрессии генов9медь-связывающихбелковприводиткразвитиютяжелыхзаболеваний(опухолевый рост, нейродегенерация, диабет, остеопороз и др.), знания ометаболизме меди в отдельных органах и его специфическом изменении в течениеонтогенеза являются важными для установления этапов, нарушения в которыхмогут приводить к развитию патологических процессов.

Кроме того, полученныеданные в дальнейшем могут способствовать выяснению причин повышенияконцентрации меди в печени и повышения уровня церулоплазмина в крови принекоторых патологических состояниях, как, например, при росте опухолей.Методология и методы исследованияИсследование выполнено на лабораторных грызунах с применениемсовременных методов биохимии и молекулярной биологии: ОТ-ПЦР, ПЦР,электрофорез в ПААГ и агарозном геле, иммуноэлектрофорез, двумерныйэлектрофорез,иммуноблотинг,спектрофотометрическиивопределениегеле,активностихроматография,ферментовиммунопреципитация,дифференциальное центрифугирование, равновесное ультрацентрифугирование,спектрофотометрическое определение концентрации общего белка и РНК,атомно-абсорбционная спектрометрия.

Использованы методы компьютерногоанализа.Положения, выносимые на защиту1.Надпочечники влияют на метаболизм меди в печени. У АЭ крыс происходитповышение содержания ЦП и уровень его (ферр)оксидазной активности всыворотке крови. В гепатоцитах увеличивается общая концентрация меди,однакоеесодержаниевмитохондрияхснижается,изменяетсяметаллирование цитозольных и секреторных купроэнзимов, изменяетсяпротеом митохондрий.2.Впериодэмбриональногоаккумулированнаямитохондриями.втипапечени,метаболизмамедиперераспределяетсяПерераспределениемедимежду(ЭТММ)междумедь,ядроморганелламиине10сопровождается изменением профиля или уровнем активности генов,участвующих в обмене меди. У новорожденных активность генов Ctr1 и Ccsполностью подавлена, однако относительный уровень СОД1-мРНК, белкаСОД1 и ферментативная активность СОД1 у новорожденных лишь на 30%ниже, чем у взрослых.

Следовательно, у крыс в период ЭТММ, в отличие отвзрослых, металлирование СОД1 осуществляется без участия CTR1/CCSкомплекса. Переключение на взрослый тип метаболизма меди (ВТММ)сопровождаетсяизменениемпрофиля(репрессируетсягенАtp7aиактивируется ген Аtp7b) и уровня активности (активность генов Cp, Ctr1 иCcs повышается, активность генов Мt1а понижается) генов метаболизмамеди.3.В процессе постнатального онтогенеза профиль и активность геновметаболизмамедивнадпочечникахнепретерпеваетзначительныхперестроек.

Метаболизм меди сходен с таковым в клетках негепатоцитарныхрядов.Степень достоверности и апробация результатовДанные были получены при помощи разнообразных экспериментальныхподходов, релевантным поставленным задачам, на репрезентативных группахживотных. Результаты экспериментов характеризовались воспроизводимостью,они были подвергнуты статистической обработке.Результаты исследования были доложены на российских и международныхконференциях: 15-ая Пущинская международная школа-конференция молодыхученых “Биология – наука 21 века” (Пущино, 2011), 11th International Symposiumof Metal Ions in Biology and Medicine (Кембридж, Великобритания, 2011), 16-аяПущинская международная школа-конференция молодых ученых “Биология –наука 21 века” (Пущино, 2012), 8th International Copper Meeting “Copper inBiology” (Альгеро, Италия, 2012), International Workshop on Human Disorders ofCopper Metabolism: Recent Advances and Main Challenges (Балтимор, США, 2013),Молодежная научная конференция в рамках Политехнического молодежного11фестиваля науки (Санкт-Петербург, 2013), 38th FEBS Congress 2013 “Mechanismsin Biology” (Санкт-Петербург, 2013), 42-ая Теоретическая и практическаяконференция с международным участием “Неделя науки в СПбГУ” (СанктПетербург, 2013), The FEBS EMBO 2014 Conference (Париж, Франция, 2014), 4-ыйСъезд физиологов СНГ “Физиология и здоровье человека” (Сочи – Дагомыс,2014).121.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ1.1. Биологическая роль меди1.1.1. КупроэнзимыУмлекопитающихчислокупроэнзимовзначительноменьше,чемферментов, содержащих в качестве ко-факторов ионы железа или цинка. Однакоих роль в метаболизме так значительна, что по биологическому значению медь неуступает ни цинку, ни железу. Список основных купроэнзимов млекопитающихприведен в таблице 1.1.

Он свидетельствует, что купроэнзимы контролируютбазовые процессы клетки. Так, они составляют часть антиоксидантной системы(Cu2+/Zn2+-супероксиддисмутаза, СОД1 и СОД3), участвуют в окислительномфосфорилированиитрансляционное(цитохром-с-оксидаза,созреваниеЦО),нейропептидовконтролируютпост-(пептидилглицин-гидроксилирующая монооксигеназа, ПМГ), синтез нейромедиаторов (допамин-гидроксилаза, ДБГ) и меланина (тирозиназа), формирование соединительнойткани (лизилоксидаза). Важную роль в двунаправленном транспорте железаиграют купроэнзимы семейства голубых мультимедных оксидаз – церулоплазмин,гефестин и циклопен.Таблица 1.1.Основные купроэнзимы млекопитающих, их функции, а также нарушения,вызываемые их дефицитом.КупроэнзимыЛокализацияОсновные функции1Секреторныйцерулоплазмин(ЦП, ферроксидаза)2Кровь, СМЖ,молоко, идругиевнеклеточныежидкости3ОкислениеFe(II)→Fe(III) привстраивании железа вапо-трансферрин;окисление аминов,транспорт медиОсновнойпродуцирующий орган4Печень,молочнаяжелезаНарушения,вызываемыедефицитом5Ацерулоплазминемия(характеризуетсяклинической триадой:ретинобластома,сахарный диабет,неврологическиерасстройства)131ГФИ-ЦП* (сплайсизоформа ЦП,заякоренная вмембране)Гефестин (ЦПподобный белок,ферроксидаза)Циклопен (ЦПподобный белок,ферроксидаза)СОД1 (Cu2+/Zn2+супероксиддисмутаза)СОД3 (Cu2+/Zn2+супероксиддисмутаза)Цитохром-соксидаза(ЦО)2Плазматическая мембранаклетокнегепатоцитарного рядаПлазматическая мембрана3ОкислениеFe(II)→Fe(III) примобилизации Fe(II)из клеткиВнутриклеточныемембраныЦитозоль,ядерныйматрикс,лизосомы,пероксисомы,митохондрииВнеклеточные жидкости(кровь, склераи др.)ВнутренняямембранамитохондрийПротеинлизин-6оксидаза(лизилоксидаза)Внеклеточный матриксПептидилглицин гидроксилирующаямонооксигеназа(PHM)Везикулы,мембраносвязанная ирастворимаяформыВезикулы,мембраносвязанная ирастворимаяформыМеланосомыДофамин-гидроксилаза (ДБГ)Тирозиназы (фенолоксидазы)Мозг,семенники5Нарушениеметаболизма железаТранспорт пищевогожелеза в кровотокЭнтероцитыХ-сцепленная анемияТранспорт железа изплаценты к плодуПлацентаМедь-зависимаяанемия плодаДиспропорционируетдва супероксидныханиона в кислород иперекись водородаВсе клеткиОксидативный стресс,семейная формаАЛС** (2% больныхАЛС)То жеСосуды,легкие,плацента идругиеВсе клеткиТо жеФибробластыДефекты сосудов,костей, хрящей,сухожилийГипоталамогипофизарнонадпочечниковая системаСнижение продукцииэнкефалинов,множественныенарушения системорганизмаНейрологическиедефекты, гипотермия,гипотензияПереносит электроныот цитохрома с на О2,перекачиваетпротоны вмежмембранноепространствоДезаминирует Rгруппы остатковлизина втропоколлагене итропоэластине,обеспечиваяобразованиековалентных сшивокмеждусубъединицами этихбелковАмидирует Сконцевой глицин внейропептидах,образующихся из ихпредшественниковПревращаетдиоксифенилаланин(ДОПА) внорадреналинСинтез меланина изтирозина4МозгМозг, кожаДефицит АТФ иснижение всехфункций организмаДепигментация,нарушениенейрогенеза*ГФИ – гликозилфосфатидилинозитоловый якорь; **АЛС – амиотрофический латеральныйсклероз.14Церулоплазмин (ЦП) – голубой белок сыворотки крови, связывающий до95% сывороточной меди.

ЦП является α-гликопротеином, состоящим изединственной полипептидной цепи, содержащей 1046 аминокислотных остатков.Молекулярный вес белка составляет около 132 кДа, однако может варьировать взависимости от состава углеводных компонентов (Koschinsky et al., 1986). ПроцесссозреваниябелкавгепатоцитахвключаетпосттрансляционноеN-гликозилирование, в результате которого ЦП получает три олигосахаридныецепи, содержащие остатки сиаловых кислот. Две из этих цепей являютсядвухантеннымииоднатрехантенной.Клонированиеисравнительнаяхарактеристика первичной структуры ЦП человека, крысы и мыши показала, чтоих аминокислотные последовательности совпадают на 90% (Fleming and Gitlin,1990).

Гликозилирование не является необходимым для встраивания атомов медив молекулу ЦП, однако играет роль в обороте белка в организме, а также восуществлении ферментативной активности (Healy and Tipton, 2007).Молекула ЦП содержит шесть сайтов для связывания меди. Атомы медитипа I связываются тринуклеарным кластером, располагающимся междудоменами 1 и 6 и составленным сайтами связывания меди доменов 2, 4 и 6.Перенос заряда между содержащими серу остатками цистеина и атомами меди вданном кластере обеспечивает поглощение при 610 нм, благодаря чему растворЦП приобретает характерное голубое окрашивание (Calabrese et al., 1989).Данный участок, связывающий три атома меди, важен не только длякаталитической активности фермента, но также и для поддержания стабильностиего структуры (Vachette et al., 2002).