Диссертация (Молекулярно–генетические и клеточные механизмы дифференцировки симбиотического клубенька), страница 4

Следует отметить, что в результатеиспользования мутагенеза выявляются регуляторные гены, представленные вВведение19геноме единичными копиями. Тем не менее, проблемы, характерные длятрадиционных бобовых культур, связанные с большими физическимиразмерами геномов и трудностями при разработке эффективных протоколовтрансформации, привели к тому, что последовательности данных геновдолгое время оставались не идентифицированными.Вначале90-хгодовпрошлогостолетиявисследованияхбобово-ризобиального симбиоза в качестве модельных растений сталиактивно использоваться два вида бобовых растений: Lotus japonicus (Regel)K.

Larsen и Medicago truncatula Gaertn. (Stougaard, 2001). Модельные бобовыерастения обладают рядом преимуществ при проведении молекулярнобиологических исследований, по сравнению с традиционными видамисемейства Бобовых. Они характеризуются небольшими размерами геномов иразработанными протоколами эффективной генетической трансформации(Barker et al., 1990; Handberg, Stougaard, 1992; Udvardi, 2001). Для модельныхбобовых растений были получены большие коллекции мутантов сиспользованиемхимического,Т-ДНК-иинсерционногомутагенеза(Stougaard, 2001; Stacey et al., 2006a). В результате у лядвенца японского былклонирован первый симбиотический ген бобовых растений — Nin (Noduleinception) (Schauser et al., 1999).

Это открыло путь к идентификациисимбиотических генов важных для сельского хозяйства растений сиспользованием геномной синтении и микросинтении (Oldroyd, Downie,2004; Stacey et al., 2006a; Kouchi et al., 2010; Борисов et al., 2011).Использованиегеномнойсинтениидлявыявленияпоследовательностей симбиотических генов важных для сельского хозяйствабобовых растений требует проведение детального генетического анализаколлекций симбиотических мутантов. С использованием 7-ми различныхгенотипов у гороха было индуцировано более 200 независимых мутантов(Borisov et al., 2004). Генетический анализ полученных мутантов позволилвыявить более 40 регуляторных генов, вовлеченных в контроль развитияВведение20клубенька (Borisov et al., 2004).

Следует отметить, что полученные мутантыраспределены по группам комплементации неравномерно, имеются как«горячие точки» мутагенеза, так и группы комплементации, представленныелишь единичными мутациями. Более того, для ряда идентифицированныхгенов были описаны серии мутаций, полученные только на основе одногоопределенного исходного генотипа. Это может свидетельствовать осуществовании генотипической специфичности, влияющей на возникновениемутаций в тех или иных симбиотических генах данного генотипа. Не менееважным является вопрос об общем числе генов, вовлеченных в контрольазотфиксирующего симбиоза, которые могут быть выявлены с помощьюмутагенеза.Использованиев различныхпрограммахпомутагенезуразличных исходных генотипов пока не дает возможности ответить на этивопросы.Поэтомуважнойзадачейявляетсяполучениеновыхсимбиотических мутантов с использованием одного исходного генотипа.Решение данной задачи позволит выявить общее число симбиотическихгенов,контролирующихразвитиеклубенька,атакжепроверитьпредположение о существовании генотипической специфичности мутагенеза.Важным вопросом является то, какие именно гены следует считатьсимбиотическими.

Достижения молекулярной генетики выявили как гены,чьифункцииспецифичныдлясимбиогенеза,частотакиегеныспециализировались в результате дупликации исходного гена. В то же времявыявлены гены, чья активность необходима для развития клубенька, но онитакже задействованы в других программах развития растений. Кроме того, наразвитие симбиоза могут влиять и гены, задействованные в другихпрограммах развития растений. В данном исследовании изучались гены изпервой и третьей группы.Следуетотметить,чтоизучениемутантовнеспособныхкклубенькообразованию позволило выявить, что некоторые из них также неспособны к формированию симбиоза с эндомикоризными грибами (Duc et al.,Введение1989).21Дальнейшиеисследованияпозволиливыявитьобщиегены,вовлеченные в развитие как бобово-ризобиального, так и эндомикоризногосимбиозов (Stracke et al., 2002; Markmann et al., 2008).

Это позволило сделатьважные эволюционные обобщения о развитии бобово-ризобиальногосимбиоза на основе более древнего эндомикоризного (Parniske, 2008).Азотфиксирующий клубенек служит уникальной экологической нишейдля ризобий, в которой поддерживаются микроаэробные условия дляфункционирования основного фермента азотфиксации — нитрогеназы,которая крайне чувствительна к кислороду (Oldroyd, 2013). Для размещенияризобийвсимбиотическомклубенькедифференцируютсяспециализированные инфицированные клетки, которые проходят несколькораундов эндоредупликации, увеличиваясь при этом в размерах, и становятсяспособными дать приют тысячам бактерий.

При этом необходимо отметить,что ризобии остаются изолированными от цитоплазмы растительной клеткимембраной растительного происхождения с включением бактериальныхбелков — симбиосомной мембраной (Brewin, 2004). Ризобии такжедифференцируются в специализированную для азотфиксации форму —бактероиды, которые вместе с окружающей их симбиосомной мембраной,формируют симбиосомы (Tsyganova et al., 2018). Формирование симбиосомнапоминает развитие некоторых хронических инфекций у млекопитающих,но при этом у них, в отличие от бобовых растений, не формируютсяспециализированные инфицированные клетки (Isberg et al., 2009).

Такимобразом, инфицированная клетка симбиотического клубенька представляетсобой уникальную для бобовых растений систему, появившуюся в ходеэволюции для обеспечения адаптации растений к нехватке азота в почве иобеспечивающую их симбиотрофное питание.

В то же время следуетзаметить,чтоклубенька,заполнениюмеханизмыобеспечивающиедифференцировкиспособностьмногочисленнымиклетоксимбиотическогорастительнойсимбиосомами,авклеткикеепоследствиеихВведение22функционирование остаются недостаточно изученными. Коллекция мутантовпо симбиотическим признакам является удобным инструментом дляисследованиямолекулярно-генетическихдифференцировкиклетокисимбиотическогоклеточныхклубенька,механизмовт.к.позволяетантропогеннойнагрузки,использовать адекватные генетические модели.Всвязиспостояннымсельскохозяйственныеувеличениемрастенияподвергаютсядействиюразличныхстрессовых факторов. К наиболее существенным факторам, влияющим наразвитие сельскохозяйственных растений, следует отнести тяжелые металлы,радиоактивноезаражение, засуху,засоление иуплотненные почвы,формирующиеся в результате использования тяжелой сельскохозяйственнойтехники.

Следует отметить, что бобово-ризобиальный симбиоз с однойстороны является весьма чувствительным к действию стрессовых факторов(Zahran, 1999; Chen et al., 2003), а с другой стороны — может способствоватьадаптации растения к действию стрессора.Такимобразом,цельюданнойработыявлялосьвыявлениемолекулярно-генетических и клеточных механизмов дифференцировкисимбиотического клубенька в норме и под воздействием абиотическихстрессорных факторов.Для достижения поставленной цели были сформулированы следующиезадачи:1.

Расширить коллекцию симбиотических мутантов гороха — получитьновые генетические модели — для изучения симбиогенеза. Для этогополучить с помощью экспериментального мутагенеза лабораторной линиигороха SGE новые симбиотические мутанты с нарушениями развитияклубеньков и провести их генетический анализ.2. Выявить основные симбиотические локусы гороха, контролирующиеранние стадии реализации генетической программы симбиогенеза.Введение3.23Разработатьхозяйственнопринципызначимымнапереходапримереотмодельныхидентификациисистемгенакгороха,ортологичного гену лядвенца LjNIN, являющегося первым клонированнымгеном бобовых растений и ключевым регулятором симбиогенеза на раннихстадиях.4. Изучить роль арабиногалактанпротеин-экстензинов и пероксидаводорода в реализации генетической подпрограммы инфекции тканейклубенька ризобиями у гороха.5.Изучитьрольреорганизациитубулиновогоцитоскелетавдифференцировке клеток симбиотических клубеньков гороха и M. truncatulaпри реализации поздних этапов генетической программы симбиогенеза.6.

Изучить роль этилена в реализации ранних и поздних этаповгенетической программы симбиогенеза у гороха.7. Изучить роль нитратов в реализации генетической программысимбиогенеза у гороха и L. japonicus.8. Изучить изменения в характере экспрессии генов Rhizobiumleguminosarum bv. viciae при реализации генетической подпрограммыинфекции тканей клубенька ризобиями у гороха.9. Изучить проявления защитных реакций со стороны растения приреализации поздних этапов генетической программы симбиогенеза.10.

Изучить финальную стадию дифференцировки клубеньков —старение, завершающую реализацию генетической программы симбиогенеза.11. Получить генетическую модель и исследовать влияние кадмия наразвитие корневой системы и симбиотических клубеньков у гороха. Изучитьвозможности создания и использования растительно-микробной системы дляфиторемедиации почв, загрязненных кадмием.Введение2412. Получить генетическую модель и исследовать влияние плотныхпочв на развитие корневой системы и симбиотических клубеньков у гороха.Научная новизнаЗначительно расширена коллекция симбиотических мутантов гороха —получены новые генетические модели — для изучения симбиогенеза.Выявлены новые серии аллельных мутантов для ряда групп комплементациисимбиотических генов гороха и описан новый локус — Pssym42.