Диссертация (Молекулярно–генетические и клеточные механизмы дифференцировки симбиотического клубенька), страница 3

3753.13.3. Анализ содержания кадмия у линии дикого типа SGE и мутантаSGECdt ........................................................................................................... 3753.13.4. Анализ влияния хлорида кадмия на организацию микротрубочек вкончиках корней линии дикого SGE и мутанта SGECdt ..........................

3773.13.5. Первичная локализация локуса cdt (cadmium tolerance) нагенетической карте гороха с использовванием метода SSAP (sequencespecific ampliphied polymorphism) ............................................................... 3783.13.6.Точнаялокализациялокусаcdt(cadmiumtolerance)нагенетической карте гороха с использовванием молекулярных маркеров........................................................................................................................ 3823.13.7. Анализ влияния хлорида кадмия на развитие симбиотическихклубеньков .................................................................................................... 3883.13.8. Анализвлиянияхлоридакадмиянафункционированиесимбиотических клубеньков .......................................................................

3933.13.8.1 Гистологическаяиультраструктурнаяорганизациясимбиотических клубеньков гороха дикого типа SGE и мутантаSGECdt ...................................................................................................... 3933.13.8.2 Гистологическаяиультраструктурнаяорганизациясимбиотических клубеньков гороха линии дикого типа SGE и мутантаSGECdt при воздействии 100мкМ CdCl2............................................... 3963.13.8.3 Ультраструктурнаяорганизациясимбиотическихклубеньков гороха линии дикого типа SGE и мутанта SGECdt привоздействии 1000мкМ CdCl2. .................................................................

4003.14. Получение трансгенных штаммов R. leguminosarum и изучениевозможности создания и использования растительно-микробной системыдля фиторемедиации почв, загрязненных кадмием ..................................... 4053.14.1 Создание генетических конструкций nifH-PsMT1 и nifH-PsMT2 4053.14.2 Клонирование генетических конструкций nifH-PsMT1 и nifHPsMТ2всоставевектораpAL-TA ианализихнуклеотидныхпоследовательностей.................................................................................... 4063.14.3 Клонирование конструкций nifH-PsMT1 и nifH-PsMТ2 в составевектора pCAMBIA0390 и введение их в типовой штамм клубеньковыхбактерий R.

leguminosarum bv. viceae 3841................................................ 4073.14.4 Анализ процента сохранения плазмид у трансгенных штаммов ивлияния хлорида кадмия на наследование pCAMBIA-nifH-PsMT2 ......... 4073.14.5 Анализ влияния хлорида кадмия на биомассу растений гороха,инокулированных трансгенными штаммами R. leguminosarum 3841PsMT1 и 3841-PsMT2 ................................................................................... 4093.14.6 Анализ содержания кадмия в растениях гороха, инокулированныхтрансгенными штаммами R.

leguminosarum 3841-PsMT1 и 3841-PsMT2........................................................................................................................ 4113.14.7 Анализ экспрессии генов PsMT1 и PsMT2 в клубеньках растенийгороха, инокулированных трансгенными штаммами R leguminosarum3841-PsMT1 и 3841-PsMT2 ......................................................................... 4133.15.

Получение генетической модели для исследования влияния плотныхпочв на развитие корневой системы и симбиотических клубеньков у гороха............................................................................................................................ 4163.15.1. Скрининг мутантов с измененной чувствительностью к плотностисубстрата ....................................................................................................... 4163.15.2. Комплементационный анализ ......................................................... 4173.15.3.

Локализация локуса Pscrt ................................................................ 4183.15.4. Анализ проявления мутантного фенотипа в зависимости отплотности субстрата..................................................................................... 4183.15.5. Анализ гормонального статуса мутанта SGEcrt ........................... 4203.15.6. Анализ организации тубулинового цитоскелета в кончиках корнеймутанта SGEcrt ............................................................................................. 4233.15.7. Анализ влияния мутации Pscrt на клубенькообразование .......... 425ЗАКЛЮЧЕНИЕ ...............................................................................................................................................431ВЫВОДЫ ...........................................................................................................................................................444БЛАГОДАРНОСТИ.......................................................................................................................................447СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................................................................449Список сокращений15Список сокращенийАВГ — аминоэтоксивинилглицинАГ — аппарат ГольджиАФК — активные формы кислородаАЦК — 1-аминоциклопропан-1-карбоновая кислотаДПИ — дней после инокуляцииИУК — индолилуксусная кислотаЛПС — липополисахаридыНПИ — недель после инокуляцииПЦР — полимеразная цепная реакцияЭМС — этилметансульфонатЭПР — эндоплазматический ретикулумSSAP — sequence specific amplified polymorphismВВЕДЕНИЕВ последние годы во всем мире активно развивается «адаптивное»,«устойчивое»сельскоехозяйство(отангл.sustainableagriculture),направленное на производство полноценной, экологически чистой иоздоровляющей сельскохозяйственной продукции (Lal, 2008; Conway,Barbier, 2013).

Для развития данного направления необходимы разработка,апробирование и внедрение новых агротехнологий, позволяющих получитьтакого рода продукцию. Разрабатываемые агротехнологии в областиземледелия должны отвечать определенным требованиям, а именно:минимизировать экологические риски, способствовать поддержанию, илидаже повышению плодородия почв, обеспечивать создание новых видовсельскохозяйственной продукции. Для выполнения этих условий необходиморазвивать новые подходы к использованию генетических ресурсов не толькорастений, но и микроорганизмов.

Привлечение микроорганизмов позволитзначительно повысить разнообразие используемых генетических ресурсов ибудет способствовать развитию адаптивного земледелия (Tikhonovich,Provorov, 2011). В результате многочисленных исследований становитсяясно,чтовходеэволюциирастенияиспользовалиопределенныефункциональные возможности микроорганизмов для расширения своегоадаптивного потенциала. Для этого в геноме растений появлялисьгенетические факторы, обеспечивающие создание новых экологических нишВведение17для микроорганизмов, при этом гены, обеспечивающие проявление самойадаптации, оставались в геноме микроорганизмов.

Одним из ярких примероврасширениярастениямисвоегоадаптивногопотенциалазасчетмикроорганизмов является формирование на корнях бобовых растенийсимбиотических азотфиксирующих клубеньков. При этом многочисленныегены бобовых растений вовлечены в построение собственно клубенька(Борисов et al., 2011), в то же время как за сам процесс азотфиксацииответственны гены почвенных протеобактерий бактерий — ризобий (Cooper,2007).

Таким образом, очевидно, что использование растительно-микробныхсистем, в основе которых лежит азотфиксирующий симбиоз междубобовыми растениями и ризобиями, представляет чрезвычайно большойинтерес для развития адаптивного земледелия(Tikhonovich, Provorov, 2011;Das, Ghosh, 2012; de Vries, Bardgett, 2012; Rubiales, Mikic, 2015). Широкоеиспользование бобовых растений в адаптивном сельском хозяйстве позволитувеличить биологическую азотфиксацию, снизить энергетические затраты,улучшить физические свойства почвы, повысить ее биоразнообразие (Courtyet al., 2015; Peix et al., 2015).

Кроме того, бобовые растения являютсяважными пищевыми и кормовыми культурами, являясь в некоторыхрегионах основными культурами (Vaz Patto et al., 2015). При этом возрастаетрольБобовыхвкачествекормовыхкультурдляпроизводствавысококачественной молочной и мясной продукции (Boelt et al., 2015).Cимбиотическая азотфиксация приковывает внимание ученых напротяжении уже более ста лет. Такой интерес объясняется исключительнойважностьюпроцессасимбиотическойазотфиксациинетолькодлясельскохозяйственного производства, но и для фундаментальной биологии.Развитие клубенька сопровождается различными изменениями в базовыхпроцессах, происходящих в клетке.

Факультативность формированияклубеньков делает их уникальной моделью для изучения различных вопросовфункционированияэукариотическойклетки,посколькустановитсяВведение18возможным изучать проявления мутаций, нарушающих развитие клубенька,что невозможно при изучении других, жизненно важных органов растения.Впервые генетическая изменчивость по симбиотическим признакам всемействе Бобовые была выявлена еще в 20-х годах прошлого столетия,когда нашими соотечественниками Л.И.

Говоровым и З.Г. Разумовской былиописаны местные сорта гороха из Афганистана, неспособные формироватьклубеньки при инокуляции европейскими штаммами ризобий (Говоров, 1928;Разумовская, 1937). Позднее в трудах английского исследователя Ф.С.Натмана при исследовании клевера были выявлены спонтанные мутации,нарушающие развитие клубеньков (Nutman, 1946). Анализ дикорастущихпопуляций различных бобовых растений для выявления спонтанных мутацийдолгооставалсяосновнымметодомдлявыявлениягенетическойизменчивости по признаку клубенькообразования (Lie, 1971).С80-хгодовпрошлогостолетиявисследованияхразвитияазотфиксирующих клубеньков стали активно применяться методы анализадифференциальной экспрессии генов (van Kammen, 1984). В результате былопоказано, что при дифференцировке клубеньков заново синтезируетсяпорядка 20–30 новых полипептидов (нодулинов), а также заметноактивируется синтез еще нескольких полипептидов.

В то же время функциинодулиновоставалисьнеизвестными,предполагаласьихролькакструктурных компонентов (Long, 1996).Наряду с молекулярными исследованиями для раскрытия потенциалагенетической изменчивости стал активно применяться экспериментальныймутагенез. В результате были созданы обширные генетические коллекциидля различных видов семейства Бобовых (Bhatia et al., 2001a). Одна из самыхпредставительных коллекций мутантов по симбиотическим признакам быласоздана для гороха (Borisov et al., 2000).