Диссертация (Молекулярно–генетические и клеточные механизмы дифференцировки симбиотического клубенька), страница 10

У M. truncatula MtDMI3 содержит кальмодулинсвязывающий домен / домен автоингибирования между аминокислотнымиостатками326и355. Былопоказано,чтоделециикальмодулин-связывающего домена / домена автоингибирования (MtDMI3∆328–355), илиделеции, приводящие к изоляции киназного домена MtDMI3 от остальногобелка (MtDMI3 1–326 и MtDMI31–311) приводят к автоактивации MtDMI3 иконститутивному субстратному фосфорилированию in vitro, которое независит от ионов кальция и кальмодулина.

Растения дикого типа и мутантныерастения Mtdmi3–1, трансформированные конструкциями MtDMI3 1–311 иMtDMI31–326,экспрессирующиесяподпромоторомгенаMtDMI3Обзор литературы56формировали спонтанные клубеньки без обработки корней Nod-факторамиили ризобиями. По своей структурной организации такие клубеньки былисхожи с нормальными азотфиксирующими клубеньками. Важно отметить,что такого рода клубеньки оставались неинфицированными и при заражениитрансформированных растений ризобиями. Это указывает на то, чтополноразмерный белок MtDMI3 необходим для проникновения ризобий(Gleason et al., 2006).Рисунок 8. — Регуляция CCaMK(a) Негативная авторегуляция CCaMK I типа.

Частичное представлениеCCaMK, состоящей из домена автоингибирования (обозначен оранжевымцветом), частично перекрывающегося с кальмодулин-связывающим доменом(CaMBD, обозначен голубым цветом), основанное на моделировании погомологии с кристаллической структурой CaMKII. Расположение активногоцентра киназы схематично изображено серым цветом. При отсутствиикальция CCaMK автоингибирована. Домен автоингибирования имеетспиральную структуру и действует как молекулярный тормоз, влияющий накиназную активность. При отсутствии кальция консервативный сайтОбзор литературы57автофософорилирования T265 CCaMK у L. japonicus, расположенный вкиназном домене, участвует в сети водородных связей (включающей остаткиS237, K264, E313 и R317), стабилизирующих спиральную структуру доменаавтоингибирования.(b) Активация CCaMK через автофосфорилирование (или замену) T265.В присутствии ионов кальция, которые связываются с C-концевымимотивами спираль-петля-спираль (на рисунке не обозначены), CCaMKавтофосфорилируется в положении T265.

Негативный заряд фосфатнойгруппы нарушает сеть водородных связей, таким образом дестабилизируясостояние автоингибирования. Подобное нарушение водородных связейтакже наблюдается в случае замены T265 фосфомиметичной аминокислотой(например, аспарагиновой кислотой T265D), или неполярными остатками(T265A, T265I). Аналогично, замена R317H также нарушает сеть водородныхсвязей. В соответствии с этой моделью функции T265 все мутанты с потерейавтоингибирования формируют спонтанные клубеньки при отсутствииризобий.(c) Активация CCaMK в присутствии ионов кальция и кальмодулина.Автофосфорилирование CCaMK усиливает связывающую способностькальция/кальмодулина, указывая на повышенную доступность CaMBD. Поаналогии с CaMKII, кальций/кальмодулин связывание ведет к структурнойреорганизации домена автоингибирования/CaMBD, вследствие чегоингибиторныйсегментпринимаетвытянутуюконформациюинеструктурированный CaMBD становится спиральным.

Это индуцированноеконформационное изменение открывает доступность к каталитической щели,в результате чего CCaMK характеризуется высокой активностьюсубстратногофосфорилирования.S337являетсяновымидентифицированным регуляторным сайтом автофософорилирования вCaMBD, который позволяет связывание с кальмодулином только внефосфорилированном состоянии.(d) Негативная регуляция CCaMK II типа. Автофосфорилирование вположении S337 нарушает кальций / кальмодулин связывание ипредотвращает структурную реорганизацию домена автоингибирования /CaMBD домена, стабилизируя таким образом состояние автоингибирования.Фосфомиметическая версия CCaMKS337D нарушена в кальций /кальмодулин стимулируемом субстратном фосфорилировании in vitro и неведет к восстановлению симбиоза, когда экспрессируется в мутанте ccamk.Напротив, мутант ccamk–14 (S337N) формирует нормальные (но неспонтанные клубеньки), и инфекция в коре корня является абберантной, чтоуказывает на то, что эта негативная авторегуляция является необходимой длявнутриклеточной инфекции (Singh, Parniske, 2012).Обзор литературы58У L.

japonicus была выявлена серия мутантов в локусе spontaneousnoduleformation(Ljsnf),которыехарактеризовалисьформированиемспонтанных клубеньков при отсутствии ризобий. Данные клубенькиобладали сходным строением с клубеньками дикого типа, но в нихотсутствовали инфекционные структуры (Tirichine et al., 2006b).

У мутантаLjsnf1 мутация приводит к аминокислотной замене в 265 положении (треонинна изолейцин), которое является сайтом автофосфорилирования (Tirichine etal., 2006a). В настоящее время считается, что подобная мутация нарушаетсистему водородных связей, которые участвуют в стабилизации доменаавтоингибирования CCaMK (Singh, Parniske, 2012).Было показано, что субстратом, который фософорилирует CCaMKявляется транскрипционный фактор LjCYCLOPS у L. japonicus, MtIPD3 у M.truncatula и PsSym33 у P. sativum.У M. truncatula был выявлен белок MtIPD3 (Interacting protein withDMI3), который взаимодействует через C-концевой сoiled-coil домен сMtDMI3, как было показано с использованием двухгибридной дрожжевойсистемы и бимолекулярной флуоресцентной комплементации (Messinese etal., 2007).

Ген MtIPD3 экспрессируется в корнях и его экспрессияусиливается при инокуляции корней, к 5 ДПИ наблюдается падение уровняэкспрессии, который повышается снова к 15 ДПИ, что совпадает схарактеромэкспрессиигенаMtDMI3.КакиMtDMI3,MtIPD3характеризуется ядерной локализацией (Messinese et al., 2007).Позднее у L. japonicus был идентифицирован ген LjCYCLOPS, которыйкодируетбелокскороткимC-концевымсoiled-coilдоменомифункциональным сигналом ядерной локализации (Yano et al., 2008). БылипоказанаколокализацияLjCYCLOPSиLjCCaMKвядреиихвзаимодействие, при этом LjCYCLOPS является субстратом, которыйфософорилирует LjCCaMK. Анализ серии аллельных мутантов LjcyclopsОбзор литературы59выявил, что у мутантов формируются клубеньковые примордии, нодальнейшего развития клубеньков не происходит.

У мутанта Ljcyclops–3наблюдаласьколонизацияинфекционныенитинескручиванияразвивались.корневогоЭкспрессияволоска,однакоподLjCCaMKT265Dконтролем промотора CaMV 35S в корнях дикого типа приводит кформированию спонтанных клубеньков, как уже было отмечено выше.Примечательно, что экспрессия этой же конструкции в корнях мутантныхрастений Ljcyclops–4 не влияла на характер формирующихся спонтанныхклубеньков, что позволило предположить авторам, что LjCYCLOPS неявляется необходимым для органогенеза клубенька, но требуется дляразвития инфекции (Yano et al., 2008).Последующее изучение мутантов по гену MtIPD3 и ортологичномугену PsSym33 показало, что эти гены вовлечены в контроль не толькоразвития инфекционных нитей, но и симбиосом (Ovchinnikova et al., 2011).Тем не менее, проведенные детальные исследования LjCYCLOPSпоказали, что он является ключевым геном, контролирующим органогенезклубенька (Singh et al., 2014).

Было выявлено 5 сайтов фосфорилированиясерина, два из которых S50 и S154 являются важными для симбиоза. Заменасерина в этих положениях на фосфомиметическую аспарагиновую кислотупри трансформации корней, конструкцией с изменной версией LjCYCLOPS,приводила к формированию спонтанных клубеньков не только у растенийдикого типа, но и у мутантов Ljcyclops–3 и Ljsymrk–3 и Ljsymrk–13.

Такимобразом,фосфорилированиеLjCYCLOPSявляетсядостаточнымдляинициации процесса органогенеза клубенька, указывая, что LjCYCLOPSявляется геном — мастером-регулятором — органогенеза клубенька. Былопоказано,чтосвязывающимLjCYCLOPSявляетсятранскрипционнымCCaMK-регулируемымактиватором.ДНК-ФосфорилированиеLjCYCLOPS в положениях S50 и S154 ведет к конформационнымизменениям,высвобождающимДНК-связывающийдомен(BD)отОбзор литературы60автоингибирования N-концевым регуляторным доменом (RD). После этогоLjCYCLOPS связывается с CYC-боксом промотора гена LjNIN, индуцируяего экспрессию, что, в свою очередь, ведет к органогенезу клубенька (Singhet al., 2014) (Рисунок 9).Рисунок 9.

— Предполагаемая функция комплекса CCaMK/CYCLOPS вдекодировании кальциевых осцилляций, ведущего к развитиюсимбиотического клубенькаCCaMK и CYCLOPS формируют предварительно собранныйнеактивный и автоингибированный комплекс в ядре клетки корня, в которомCYCLOPS формирует димер. После инициации нуклеарных кальциевыхосцилляций, ионы кальция и кальмодулин активируют CCaMK, котораяфосфорилирует CYCLOPS в положениях S50 и S154.

ФосфорилированиеCYCLOPS индуцирует конформационные изменения, высвобождающиеДНК-связывающий домен (BD) от автоингибирования N-концевымрегуляторным доменом (RD). Далее CYCLOPS связывается с CYC-боксом впромоторе гена NIN и запускает основную транскрипционную машинупосредством активационного домена (AD), индуцируя экспрессию NIN, что всвою очередь активирует экспрессию NF-YA1 и приводит к органогенезуклубенька (Singh et al., 2014).LjNIN (Nodule inception) у L.

japonicus явился первым симбиотическимгеном, чья нуклеотидная последовательность была выявлена у семействаОбзор литературы61Бобовых (Schauser et al., 1999). Мутанты по этому гену характеризовалисьотсутствием инициации клеточных делений внутренней коры корня иперицикла — характерной реакции в ответ на инокуляцию. В то же время умутантов наблюдались скручивания корневых волосков, причем их числобыло сильно увеличено, по сравнению с диким типом. LjNIN кодируеттранскрипционный фактор c ДНК-связывающим RWP-RK доменом, которыйактивно экспрессируется не только в молодых, но и в зрелых клубеньках. Вразвивающихся клубеньках транскрипты были идентифицированы в клеткахклубеньковыхпримордиев,неинфицированныхИнтереснойиконтролирующегозрелыхинфицированныхособенностьюChlamydomonas,вявляетсявовлеченноговразвитиеминусв—проводящихклеткахсходствоопределениегаметвопучках,центральнойLjNINтипавремяизоны.белкаспариванияMidигаметогенеза,индуцируемого дефицитом азота, который также необходим для развитиясимбиотического клубенька (Schauser et al., 1999).

У M. truncatula быливыявлены два мутанта: Mtnin–1 и Mtnin–2, которые также характеризовалисьчрезмерным скручиванием корневых волосков и отсутствием делений в корекорня,хотяумутантаMtnin–2иногдаинициировалосьразвитиеинфекционных нитей, которые, однако абортировались в корневом волоске,что свидетельствует, что Mtnin–2 является слабой аллелью (Marsh et al.,2007).